肾康注射液细菌内毒素检查法的研究

李晓春+王莉芳+徐长根

摘 要：目的 建立肾康注射液细菌内毒素检查方法，以期能够替代家兔热原法控制产品的热原，达到快速、高效、可靠、简便的目的。方法 按《中国药典2015年版四部》通则1143细菌内毒素检查法进行试验。采用两个不同厂家的的鲎试剂，对7个不同批次的样品开展干扰试验，确定最小不干扰稀释倍数，并对样品进行了细菌内毒素检查。结果 供试品4倍稀释液无干扰作用，细菌内毒素限值定为1.0 Eu/ml。结论 用细菌内毒素检查法代替热原法是可行的。

关键词：肾康注射液；细菌内毒素；鲎试剂；干扰试验

中图分类号：R927 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.01.025

文章编号：1006-1959（2018）01-0070-04

Study on Bacterial Endotoxin Test of Shenkang Injection

LI Xiao-chun，WANG Li-fang，XU Chang-gen

（Shaanxi Province Food and Drug Inspection Institute，Xi'an 710065，Shaanxi，China）

Abstract：Objective To establish a bacterial endotoxin test for Shenkang injection in order to replace the pyrogen of rabbits' pyrogen control system and achieve the goal of rapid，high efficiency，reliability and simplicity.Methods According to the"Chinese Pharmacopoeia 2015 edition four"general rule 1143 bacterial endotoxin test method for testing.Tropsch reagents from two different manufacturers were used to perform interference tests on 7 different batches of samples to determine the smallest non-interfering dilution and bacterial endotoxin testing of the samples.Results 4-fold dilution of the test sample without interference，bacterial endotoxin limits set at 1.0 Eu/ml.Conclusion Bacterial endotoxin test instead of pyrogen method is feasible.

Key words：Shenkang injection；Bacterial endotoxin；Tropsch reagent；Interference test

腎康注射液为黄棕色澄明液体，可降逆泄浊、益气活血、通腑利湿，适用于慢性肾功能衰竭属湿浊血瘀证[1-4]。《中国药典2015年版四部》通则9301注射剂安全性检查法应用指导原则中明确指出静脉用注射剂均应设细菌内毒素或热原检查项。目前，肾康注射液现有质量标准SFDA标准（试行）YBZ08522004中是用家兔法控制热原的，家兔法存在试验条件要求高、操作繁琐、影响因素多、动物个体差异大等缺点，而细菌内毒素检查法具有快速灵敏、重现性好、简便易行等优点[5-8]。因此对于肾康注射液更倾向于采用细菌内毒素检查法。基于此，本文通过实验探讨细菌内毒素检查法应用于肾康注射液的可行性，为提高该产品的质量控制提供一定的参考依据。

1材料与方法

1.1材料 肾康注射液（规格20ml/支，批号2016010 32、201601031、201601033、201603021、201604022、01603013、201604031）；细菌内毒素工作标准品（WSE，规格80 Eu/支，批号150601-201580，中国食品药品检定研究院）；BET水（规格5 ml/支，批号160006-201401，中国食品药品检定研究院）；鲎试剂TAL[批号1507180，湛江博康海洋生物有限公司（简称博康海洋）；批号1507202，湛江安度斯生物有限公司（简称安度斯）；规格及灵敏度分别为0.1 ml、0.25 Eu/ml]。

1.2仪器选取 DHG-9245A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；ZH-2自动涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）。

1.3方法

1.3.1鲎试剂灵敏度（λ）复核 按《中国药典2015年版四部》通则1143细菌内毒素检查法项下规定，用BET水将内毒素工作标准品制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的标准溶液。取已复溶的鲎试剂18支，其中16支分别加入0.1 ml上述不同浓度的标准溶液，每一浓度平行4支，另外2支加入0.1 mlBET水作阴性对照。

1.3.2细菌内毒素限值（L）的确定 《中国药典》规定L=K/M，注射剂K=5 Eu/（kg·h），M为人用kg·h最大供试品量，参照肾康注射液用法用量，本品为静脉滴注，1次/d 100 ml，使用10%葡萄糖液300 ml稀释，按30滴/min计算，体重按60 kg计算，则L = 3.33 Eu/ml，最终将限值定为3 Eu/ml。

1.3.3供试品最大有效稀释倍数（MVD）的确定 《中国药典》规定供试品最大稀释倍数MVD=CL/λ，国内市售鲎试剂的λ常为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 Eu/ml，则对应的供试品的MVD分别为6、12、24、48、96倍。endprint

1.3.4干扰试验预实验 用BET水将7批肾康注射液分别制成原液、2、4、6、8、12倍的系列溶液，记为供试品阴性对照（NPC）系列；制备相同倍数的供试品系列溶液，使每个溶液中都含有2 λ的内毒素，记为供试品阳性对照（PPC）系列；同时设立阳性对照（PC）管和阴性对照（NC）管。

1.3.5正式干扰试验 根据预实验结果，选择相应稀释度溶液进行正式干扰试验。以该溶液及BET水将内毒素标准品稀释成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的系列溶液，分别取0.1 ml加至已复溶的鲎试剂管内，每一浓度平行4支，另设2支阴性对照。

1.3.6供试品细菌内毒素检查 取7批肾康注射液，以其不干扰稀释溶液，用两个厂家TAL进行细菌内毒素检查，每1 ml肾康注射液中含细菌内毒素的量不得过3 Eu。

2 结果

2.1鲎试剂灵敏度复核 两批鲎试剂灵敏度测定值（λc）均在0.5 λ～2 λ之间，结果符合规定，见表1。

2.2干扰试验预实验 7批肾康注射液稀释到4倍时，可排除干扰，见表2～表3。

2.3正式干扰试验 Et/Es值均在0.5～2.0之间（Es和Et分别表示细菌内毒素标准品的BET水溶液和细菌内毒素标准品的供试品溶液反应终点浓度的几何平均值），根据《中国药典》的评判标准，肾康注射液4倍稀释液无干扰作用，说明使用鲎试剂法进行内毒素检查是可行的，见表4。

2.4供试品细菌内毒素检查 以肾康注射液的4倍稀释溶液，用两个厂家TAL进行细菌内毒素检查，结果均符合规定，见表5。

3讨论

热原是指能造成恒温动物体温异常升高的物质，有外源性和内源性之分。细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物，属外源性致热原。通常来讲，内毒素是热原，但热原不全是内毒素。严格来讲，并非每种热原都具有脂多糖结构，但所有已知的内毒素脂多糖都有热原活性。因此，在GMP环境中形成一个共识--不存在细菌内毒素即不存在热原。家兔法是通过静脉注入家兔体内一剂量的供试品，在规定时间内测其体温变化，从而判定供试品的热原限度是否符合规定。我国于五十年代将此法载入药典，而在六十年代末发明了鲎试剂法，即利用鲎试剂来检测或量化内毒素。鲎试剂法相比于家兔法，具有快捷、高灵敏度、操作简便易重现等优点，受到了现代药检的青睐。

肾康注射液属二类新药，主要成分有黄芪、大黄、丹参、红花。君药为黄芪，臣药为大黄，黄芪健脾升清，大黄通腑降浊，一升一降，二者相辅，从而化瘀祛浊。丹参、红花活血止痛，共为佐使[9]。肾康注射液在临床实践中表现出广泛的预防肾损伤，保护肾功能的作用[10]，尤其在治疗糖尿病肾病、慢性肾功能衰竭、老年慢性肾病方面功效卓著[11-13]。但是，肾康注射液成分复杂，容易造成一些不良反应的发生，热原反应较为常见[2-3，14]。因此，对这类疗效确切、应用广泛的中药注射液加强热原检查很有必要，这对保障临床用药安全，严格质量标准意义深远。

本文对肾康注射液进行了细菌内毒素干扰试验，结果表明，其4倍稀释液对鲎试剂与内毒素的反应无干扰作用，证实可建立鲎试剂法以替代家兔法控制热原，并且本文将其限值从文献[4]的4 Eu/ml提高到3 Eu/ml，严格了质量标准。为保证結果的可靠性，本文选取了两个不同厂家的鲎试剂，消除了鲎试剂可能的反应差异，并对7批肾康注射液进行了研究，增加了试验的可信度。因此，本试验为该品种在新版的国家标准中将家兔法修订为细菌内毒素检查法提供了科学依据。

参考文献：

[1]刘蔚红，高永丽，宋晓红.肾康注射液不良反应文献综述[J].中国药物滥用防治杂志，2016，22（2）：113-114.

[2]梁学芹.肾康注射液致热原反应1例案例分析[J].北方药学，2014，11（4）：149.

[3]刘宏韵.中药注射剂不良反应的特点与临床合理应用分析[J].河北医药，2013，35（1）：135-136.

[4]吴寒寅，孟德胜.肾康注射液细菌内毒素检查法的建立[J].中国药业，2011，20（8）：38-39.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版四部通则[S].北京：中国医药科技出版社，2015：154-157.

[6]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京：中国医药科技出版社，2010：310-325.

[7]周继春.甲磺酸帕珠沙星注射液细菌内毒素检查法建立[J].医药论坛杂志，2015，36（10）：48-52.

[8]张横，蔡彤，高华.盐酸莫西沙星注射液细菌内毒素检查方法学研究[J].中国药事，2014，28（12）：1298-1302.

[9]何玉华，李明权，赵良斌，等.肾康注射液联合血液透析对慢性肾功能衰竭透析次数、营养状况的临床观察[J].世界科学技术-中医药现代化，2013，15（4）：746-752.

[10]楚加元.肾康注射液药理及临床研究进展综述[J].现代中药研究与实践，2014，28（2）：76-78.

[11]蒋志伟，吕延英，夏结来，等.肾康注射液治疗慢性肾功能衰竭的Ⅳ期临床观察研究[J].中国医科大学学报，2011，40（10）：941-945.

[12]张研，王清，姜晓丹，等.肾康注射液治疗老年糖尿病肾病患者50例[J].中国老年学杂志，2013，33（10）：2353-2355.

[13]胡斯明，钱志远，施晓松，等.前列地尔联合肾康注射液治疗老年慢性肾脏病的临床疗效[J].中国老年学杂志，2015，35（22）：6533-6535.

[14]刘群.29例肾康注射液不良反应/事件分析[J].药物流行病学杂志，2012（10）：482-484.

收稿日期：2017-6-22；修回日期：2017-7-10

编辑/李桦endprint