基于HPLC-ECD法与聚类分析的中国白酒品质鉴别

于 静 孙翔宇 王宏镭 黄卫东

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院， 北京 100083； 2.北京市产品质量监督检验院， 北京 101300)

0 引言

白酒是我国传统的蒸馏酒，是世界七大蒸馏酒之一[1]。传统工艺白酒即固态法白酒，是以粮食为原料，采用固态(或半固态)糖化、发酵、蒸馏，经陈酿、勾兑而成，未添加食用酒精及非白酒发酵产生的呈香、呈味物质，具有固有风格特征的白酒[2]。随着气相色谱技术的普及和勾兑技术进步，某些白酒企业将液态法白酒通过添加特征香气成分，利用酒精进行勾兑加工，以酒精勾兑白酒冒充固态法白酒，欺骗消费者[3]。GB/T 15109—2008《白酒工业术语》规定白酒的“勾兑调味”是把具有不同香气、口味、风格的酒，按不同比例进行调配，使之符合一定标准，保持成品酒特定风格的专门技术[2]，目的是为了保证白酒的风格，而不是简单的酒精勾兑。固态法白酒与液态法白酒的标准主要区别是酒精度、总酸、总酯等理化指标的差异，白酒的分级也是通过检测上述指标的含量来判定，按照现行的检测指标，不能区分白酒的品质[4-5]。

目前白酒质量标准对白酒质量的表述主要包括：感官指标、理化指标及卫生指标。其中理化指标、卫生指标对白酒中常量或半微量的理化成分及对人体有害的成分进行了规定，并有相应的检测方法。感官品评是指评酒者运用眼、鼻、口等感觉器官对白酒样品的色泽、口味及风格特征进行分析、评价和判断。感官指标虽然也有检测方法，但要靠人的感觉器官，因个体存在差异，易受环境的影响，导致评价结果的不稳定性[6]。

目前，对于白酒的品质鉴别有大量的报道，气相色谱法[7]、电子鼻[8-9]、原子力显微镜[10]、红外光谱[11-12]、电子舌[13]等均可应用于白酒品质的鉴别。高效液相色谱库仑阵列电化学检测法(High performance liquid chromatography-coulometric electrochemical array detection, HPLC-ECD)是一种较新的检测方法，由于该方法具有较高灵敏度、高选择性，国外已经在食品、饮料等产品质量和原材料控制，农药残留检测等多个领域得到了广泛应用[14-19]，并已有在葡萄酒酚类物质测定上的应用[20-21]，而在我国传统白酒测定的应用，未见相关报道。近几年，运用HPLC-ECD方法结合化学计量学方法在食品鉴伪和品质鉴别方面有积极的贡献[22-23]。与此同时，聚类分析是研究样品分类问题的一种多元统计分析方法。按照分类方法可分为动态聚类法和系统聚类法，系统聚类法提供了强大的变量和样品分析功能，在聚类分析中应用较广泛，在白酒质量控制及真伪判别方面已有大量报道[24]。本文首先建立白酒检测的HPLC-ECD方法，之后运用化学计量学分析法对固态法白酒与酒精勾兑白酒及不同勾兑比例的白酒进行聚类分析，以期建立并拓展HPLC-ECD在我国传统白酒质量控制与真伪判别的相关方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

建立HPLC-ECD测试方法的固态法白酒与酒精勾兑白酒：本研究样品为固态法发酵白酒和不同勾兑比例的酒精勾兑白酒。固态法白酒为未经后期勾兑的清香型优级高度白酒，酒精勾兑白酒理化指标达到目前清香型优级高度白酒国标要求，所有测试样品均为北京市某一知名白酒企业(企业代号H)提供。

模型验证测试样品：委托北京4家白酒企业提供符合清香型优级白酒标准的样品，样品数量39个，其中24个为固态法白酒，15个为酒精勾兑白酒。具体样品数量见表1。

表1 白酒模型验证测试样品数量Tab.1 Test sample quantity of liquor model verification

不同勾兑比例的白酒样品：委托北京某一白酒企业(企业代号H)提供符合国家标准中清香型优级白酒标准的样品，含不同比例固态法白酒的勾兑白酒，共23个样品，其中含100%固态法白酒数量为6个，含75%固态法白酒样品数量为6个，含15%固态法白酒样品数量为5个，含10%固态法白酒样品数量为6个。

试剂：磷酸二氢钠(色谱纯)，美国Sigma公司；磷酸(色谱纯)、北京化学试剂公司；甲醇、乙腈(色谱纯)，德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

岛津LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)：配二元高压泵、SIL-20A型自动进样器、柱温箱；梅特勒-托利多公司ME204E型电子天平、FE20型pH计。5600A型库仑阵列电化学检测器(美国ESA公司)：配备8通道检测器，检测器由8个通道顺序相连，4个通道为一组，共2组，每组可单独使用，每一通道都由多空石墨工作电极、钯参比电极、铂计数电极组成，每一通道均可独立施加不同电压。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Shiseido C18(5 μm，250×4.6 mm，120 A)，前置C18保护柱(4.6 mm×5 mm)；流动相：盐相为0.03 mol/L的磷酸二氢钠水溶液；有机相为：水、甲醇、乙腈体积比为20∶40∶40，该溶液中加入磷酸二氢钠，浓度为0.03 mol/L。梯度洗脱的程序：有机相在50 min内，由20%线性升到80%。8通道电压：-150、300、400、500、600、700、800、900 mV。

电极清洗：为减少电极表面的吸附，每次分析结束后将所有电极电压设定为1 000 mV并保持5 min。流速：1 mL/min。流动相pH值：6.3。

1.3.2 样品处理

样品经过0.22 μm微孔滤膜过滤(聚醚砜)，滤液用于库伦阵列电化学检测器高效液相色谱分析。

1.4 数据分析

所有试验均重复3次，数据用3次独立数据的平均值±标准偏差表示。数据处理使用ESA软件，统计数据使用Pirouette软件。

2 结果与分析

2.1 白酒的库仑阵列电化学检测器高效液相色谱检测方法

HPLC-ECD法检测白酒样品，样品无需前处

理，检测到的物质无需定性、定量分析，色谱峰为全采集方式。检测方法优化主要从检测物质的分离度、数量及含量，方法精密度及方法稳定性确定。首先，根据试凑试验法[21]，获得最佳色谱条件，固态法白酒出峰数量102个，各检测物质分离好，并且峰形尖锐，对称性好，可满足白酒中各活性物质的检测，色谱图见图1。同时，在该条件下，为验证方法的精密度，分别在8个通道选取含量比较高的1种物质进行6次重复试验，计算结果的标准偏差，稳定性如表2所示，由表可见方法相对标准偏差小于2.39%，满足试验对精密度的要求。分别将同一样品放置0、12、24、48、72 h进行测定，选取上述8通道的数据进行稳定性试验，结果表明样品在3 d稳定性良好，相对标准偏差小于2.1%，满足试验对稳定性的要求。

图1 固态法白酒的HPLC-ECD色谱图Fig.1 HPLC-ECD diagram of Chinese spirits prodiced by traditional fermentation

表2 HPLC-ECD法测试白酒的精密度试验数据Tab.2 Precision and relative standard deviations of liquor sample

2.2 固态法白酒与酒精勾兑白酒指纹图谱及聚类结果分析

2.2.1 HPLC-ECD指纹图谱

本文分析了符合国家清香型优级白酒标准的固态法白酒与酒精勾兑白酒，所分析样品均为同一企业提供。2种白酒的HPLC-ECD指纹图谱如图2所示。

图2 酒精勾兑白酒与固态法白酒HPLC-ECD色谱图Fig.2 HPLC-ECD diagrams of Chinese spirits produced by traditional fermentation and alcohol blending

首先，两种白酒理化指标与卫生指标均符合GB/T 10781.2—2006《清香型白酒》，清香型白酒的特征成分为乙酸乙酯，是发酵过程中产生的主体香气物质。测试样品为优级高度白酒，标准要求乙酸乙酯的含量(质量浓度)应在0.60～2.60 g/L范围内，总酯(以乙酸乙酯计)含量应在1.0 g/L以上[4]。按照GB/T 10345—2007 《白酒分析方法》气相色谱检测到白酒中的酯类主要为乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯[25]，这些酯类的含量之和是白酒中总酯含量的主要来源。白酒企业可以通过人工勾兑模拟固态法白酒中酯类的含量，勾兑出符合国家标准要求的产品。依靠传统的检测方法不能区分固态法白酒与酒精勾兑白酒。

白酒是一个复杂的体系，除了含有98%(质量分数)的乙醇和水外，还含有2%的微量成分，而正是微量成分决定了白酒香气、口感和风格。微量成分可分为醇类、酯类、乙酯类、酸类、酮类、酚类、内酯类化合物、硫化物、缩醛类化合物、吡嗪类化合物、呋喃类化合物、芳香族化合物以及其他化合物[26]。库仑阵列检测器可以检测到带有电化学活性的物质，如酚、醛、芳香胺、醌、杂环胺、单胺和硝基胺等，所以应用库仑阵列高效液相色谱主要检测的是白酒中带有电化学活性的物质，这些能够在电场的作用下，发生氧化还原反应[27]，这些物质在白酒的感官品评中，对人的味觉起作用[28-29]。通过图2可以看出，固态法白酒和酒精勾兑白酒在HPLC-ECD中检测到的组分及含量有显著的差异，固态法白酒的信息峰含量明显高于酒精勾兑白酒。在相同的数据处理条件下，采集8通道的检测数据，固态法白酒能获得102个信息峰，酒精勾兑白酒能检测到79个信息峰，白酒指纹图谱信息丰富。白酒指纹图谱的建立旨在识别固态法白酒与酒精勾兑白酒并为白酒的质量控制提供有效的手段。已有报道采用HPLC-ECD法可获得山茱萸的指纹图谱，方法简单、准确，可用于山茱萸的质量控制[17]。

2.2.2 相同企业提供的白酒样品聚类分析结果

本文采用Pirouette分析软件中的系统聚类法分析相同企业提供的16个白酒样品的HPLC-CECD数据，其中6个样品为固态法白酒(G-H)，10个样品为酒精勾兑白酒(Y-H)。经过统计软件分析后生成的聚类分析树状图见图3。

图3 固态法白酒与酒精勾兑白酒聚类分析树状图Fig.3 Cluster analysis of Chinese spirits produced by traditional fermentation and alcohol blending

从图3可以看出，当酒样品被分为两类时，第1大类为固态法白酒，第2大类为酒精勾兑白酒。聚类分析法能准确区分固态法白酒与酒精勾兑白酒。当酒样被分为3类时，固态法白酒保持不变，被分为一类，酒精勾兑白酒被分为两类，这可能是由酒精勾兑的基酒及人为勾兑过程中添加的物质不同导致的。本文选取HPLC-ECD法检测白酒的8通道检测数据进行聚类分析，该方法无需对检测到的数据进行定性定量分析，采集的是白酒在谱图中的全部样品信息，很难通过人工调配进行模拟，该方法的建立为白酒的品质控制及真伪鉴别提供解决的途径。有报道采用聚类方法分析不同香型白酒中的挥发性物质，鉴别不同香型的白酒，并发现一定的规律[24,30]。

2.2.3 不同企业提供的白酒样品聚类分析结果

本文采用Pirouette分析软件中系统聚类法分析北京市4家白酒企业提供的39个样品的HPLC-ECD数据，其中24个样品为固态法白酒(G-H)，15个样品为酒精勾兑白酒(Y-H)。经过统计软件分析后生成的聚类分析树状图见图4。

图4 4家白酒企业提供固态法白酒与酒精勾兑白酒聚类分析树状图Fig.4 Cluster analysis of Chinese spirits produced by traditional fermentation and alcohol blending provided by four liquor companies

从图4可以看出，4家白酒企业提供的酒样品被分为两类时，第1大类为固态法白酒，第2大类为酒精勾兑白酒，但组间的差距相比同一企业提供的白酒样品小。不同品牌的白酒样品大部分能聚成一类，但也有小部分聚成不同类，如Y-L-1，不同企业生产的白酒因选取的原料、制曲工艺、发酵条件、蒸馏条件、勾兑技术及贮存方式的不同，白酒中微量物质种类和含量有所不同，导致白酒风格迥异[28]。聚类分析法能够正确区分不同白酒企业提供的相同香型的固态法白酒与酒精勾兑白酒，但不能准确区分不同品牌同一香型的白酒。2.2.4 不同勾兑比例白酒指纹图谱及聚类分析结果

图5 不同勾兑比例白酒色谱图Fig.5 Chromatograms of liquor with different blending proportions

图6 不同酒精勾兑比例白酒聚类分析树状图Fig.6 Cluster analysis of liquor with different alcohol blending proportions

GB/T 20822—2007《固液法白酒》中规定，固液法白酒的定义为以固态法白酒(不低于30%)、液态法白酒勾调而成的白酒[31]。其中对固液法白酒的含量做出明确的规定，但现行的检测标准不能实现固液法白酒中固态法白酒含量的测定。本文分别选取含有不同比例的固态法白酒样品进行HPLC-ECD检测，建立不同勾兑比例的白酒鉴别模型。选取白酒样品中固态法白酒的体积分数分别为10%、15%、75%和100%，4种比例的白酒样品HPLC-ECD色谱图见图5，聚类分析结果见图6。

从图6可以清楚地看出，不同勾兑比例白酒样品的分类。当样品被分为两类时，第1大类是含固态法白酒75%、100%的样品，第2大类是含固态法白酒10%、15%的样品。当样品被分为4类时，第1类是含固态法白酒100%的样品，第1类是含固态法白酒75%的样品，第3类是含固态法白酒15%的样品，第4类是含固态法白酒10%的样品。结果表明运用HPLC-ECD检测白酒，结合聚类分析方法能够实现不同勾兑比例白酒的鉴别，建立的鉴别方法能够为质监部门的白酒监管工作提供技术支持。

3 结束语

建立了白酒的高效液相电化学检测方法，在最优色谱条件下，8通道能采集固态法白酒中102个信息峰，各物质得到了很好的分离，精密度、稳定性高。使用该方法对固态法白酒与酒精勾兑白酒进行分析，发现能够检测到白酒中多种活性物质，指纹图谱信息丰富，两种白酒图谱差异明显。同时，运用聚类分析对检测数据处理，能实现准确区分固态法白酒与酒精勾兑白酒。运用该方法同时检测不同企业提供的白酒样品，检测结果表明，该方法能够准确区分相同香型的固态法白酒与酒精勾兑白酒，但不能准确区分不同品牌的白酒。进一步分析不同勾兑比例的白酒，聚类结果与实际相符，白酒样品被准确分为4类：固态法白酒体积分数分别为10%、15%、75%和100%。

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