辽宁省朝阳市猪流行性腹泻病原学调查

文│蔡洪波（辽宁省建平县八家农场动物卫生监督所）

为了解辽宁省朝阳市猪流行性腹泻的病原在季节及各个日龄的感染强度，分别采集34份血清和63份病料样品，应用RT-PCR和试纸条检测方法对病料样品和血清进行病毒核酸和抗原检测。结果显示，猪流行性腹泻在辽宁省朝阳市的各个季节和各个日龄阶段均有感染，但在气候偏寒冷的冬季容易感染和发病，主要侵害30日龄以内的哺乳仔猪，其病毒核酸阳性率高达71.4%，血清抗原阳性率高达43.2%。因此，应针对以上情况，对猪场全面采取免疫接种、消毒、环境营养控制等生物安全管理措施，尤其是在寒冷季节针对哺乳仔猪进行重点防控。

一、材料与方法

1.材料。

（1）检测样品。在辽宁省朝阳市各大养殖猪场户，分不同时间和不同日龄进行全面随机采集有腹泻症状的猪粪便或发病死亡猪肠道样品、血清。粪便和肠道内容物样品用于RTPCR病毒基因检测，血清样品用于金标试纸病毒抗原检测。上述样品采集于发病流行期间，时间为2016年4月～2017年3月。

（2）试剂盒来源。猪流行性腹泻病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒，即为反转录酶（M_MLV）、RNA酶抑制剂由Promega公司生产。RT-PCR试剂（10×Buffer，d-NTP s，TaqDNA聚合酶等）均购自TaKaRa公司。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。猪流行性腹泻抗原检测金标试纸条由山东绿都生物科技有限公司生产，批号为LD-Z01。

（3）主要仪器和用品。仪器：PCR仪GT9612，郑州市金水区南北仪器仪表商行；电泳仪JY1600C通用型，深圳市科昊实验设备有限公司。

用品：包括金标试纸条、洗板、枪头、EP管、量筒、容量瓶、匀浆器、剪刀、镊子等。

2.方法。

（2）RT-PCR检测。将制成的模板RNA解冻或现用，引物、酶、dNTP、混合液ddH2O在室温（15～25℃）解冻备用。

PCR反应步骤：变性、退火和延伸。在PCR管中按顺序添加5×Taq聚合酶buffer（包含引物）、dH2O、酶（Taq聚合酶 ）、dNTP、M2+加样本模板对照DNA。

电泳鉴定，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

（3）金标纸抗原检测。猪流行性腹泻病毒应用猪流行性腹泻抗原检测金标试纸条进行检测。

（4）猪场防控管理措施。根据猪流行性腹泻的病原学调查结果，对规模化养猪场制定了严格生物安全管理措施，其中包括猪场饲养管理制度、饲料营养、环境卫生、无害化处理、消毒制度、生物药物保健、免疫接种和疫病监测技术规程。选择朝阳市建平县华晨种猪场进行应用试验。

表1 病料样品采集份数

表2 血清样品采集份数

（5）统计学方法。所得数据采用SPSS 16.0软件进行卡方检验。

二、结果与分析

1.病料样品、血清样品采集数量。不同时间、日龄采集病料样品、血清样品份数见表1～2。

结合自己的“下水”心得和做题情境，我倾向于第三类同学的做法，因为有的放矢确实可以让阅读的目光变得更敏锐，提笔标画更有方向性和侧重点（其实关于不动笔墨不读书的道理不难懂，问题是——非知之艰，惟行之艰），不会出现要么没重点，要么处处是重点而变成没重点，耗时耗力，答题效率低下。

2.RT-PCR检测结果。63份猪流行性腹泻病毒病料样品在不同时间、日龄下RT-PCR检测结果见表3。由表得知，易感猪群在1～30日龄偏高（P＜0.01）；2016年10～11月，病毒核酸阳性率为62.5%，2017年1～3月，病毒核酸阳性率为71.4%，明显高于其他两个季度（P＜0.01）。

3.血清检测结果。34份猪流行性腹泻病毒血清样品在不同时间、日龄检测结果见表4。由表得知，1～30日龄抗原阳性率偏高（P＜0.01）；2016年10～11月，抗原阳性率为40.1%，2017年1～3月，抗原阳性率为43.2%，高于其他季度时间（P＜0.01）。

三、讨论

1.猪流行性腹泻病毒主要感染情况。上述实验的结果表明，猪流行性腹泻病毒在辽宁省朝阳市分布较为广泛，在各季节均有感染，但1～3月感染率较高，说明在气候偏寒冷的季节感染率和发病率都很高。1月龄以内的哺乳仔猪感染率和病死率最高，育肥猪和成年猪感染率较低，也容易恢复。猪流行性腹泻抗原检测金标试纸条检测结果和基因检测结果一致，其操作简便、速度快、成本低，适合临床应用。

2.猪场流行性腹泻疾病发生的诱因。根据对朝阳市各大养殖猪场户的猪病原学检测结果分析，说明该病在猪场中污染严重，但是多发生在枯草期和寒冷时期。造成发病的诱因是季节，所以在制定防范措施的过程中，要注意保持猪圈干燥，避免潮湿阴冷，及时做好防护保护措施，还要定期检测病原，制定相应的免疫程序，达到最佳的防治措施。

3.应用生物安全措施防治猪腹泻性疾病。规模化养猪场养猪数量多，猪的调动频繁，饲料周转快，所以人员车辆出入多。场内一旦有该病原微生物感染，如防范管理措施不当就会造成重大经济损失，而且这种病原微生物不易被消灭，可能长久危害猪场。因此，要制定完善的生物安全管理措施，并且严格执行才能确保养猪场健康稳定发展。

饲养管理是养殖场疫病防控的关键。首先，做好猪群饲料、饲喂、饮水的管理，使易感群具有抗病能力；其次，控制好猪群的调转、车辆及人员的出入；第三，做好场舍的消毒、出入场猪的检疫、猪舍的环境卫生、舍内的通风、控制好温度和湿度等工作；最后，定期进行病原学检测，饲料中投中药保健预防，针对性做好免疫接种。做好上述综合生物安全管理措施才能有效防控传染病的发生。

表3 养殖猪场病毒核酸检测结果统计阳性率（%）

表4 养殖猪场血清抗原检测结果统计阳性率（%）

4.猪流行性腹泻的防治。猪流行性腹泻病毒传播较慢，发病后对易感猪群及时免疫，应用猪胃腹二联疫苗免疫注射，并且在每年的秋季开始免疫。

应用中药方剂进行预防和治疗，组方：白头翁、马齿苋、良姜、石榴皮、肉豆蔻、白术、扁豆、猪苓、厚朴（制）拌料饲喂。每天1次，连续应用30天左右。

采用交叉感染方法预防，就是把发病猪的粪便投放到妊娠母猪舍，使其产生强力的母源抗体，对仔猪产生被动保护作用。该方法经过临床试验，使仔猪感染推迟进而减少死亡损失，使该病的流行时间缩短。

发病猪场要彻底消毒，每天1次，连续应用，并且还要更换消毒液。对已发病猪只进行隔离，病死猪作无害化处理。

病猪要及时口服补充糖盐水和碳酸氢钠，防止脱水和酸中毒。病情严重者，采用静脉滴注法。有条件的在饲料中添加腐殖酸钠粉。

5.诊断猪场发病情况的便捷方法。RT-PCR技术是迄今最敏感的细胞因子检测技术，而且可以直观地反映淋巴细胞产生细胞因子的能力。其缺点是操作较为烦琐，测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平，并且不容易对细胞因子表达水平进行定量。

用金标试纸检测血清抗原比较特异、方便、易标准化和批量化，很适合临床应用。其缺点是所提供的是免疫活性信息，而不是细胞因子生物活性信息。综上，这种方法更适用于诊断猪场发病情况。

四、结论

辽宁省朝阳市猪流行性腹泻病毒感染分布较广，猪流行性腹泻病毒在各季节和各日龄阶段均有感染，但在气候偏寒冷的季节容易感染和发病，且主要侵害30日龄以内的哺乳仔猪。