不同白油佐剂制备的H9N2灭活疫苗在SPF鸡上的免疫效果初试验

王友令 袁小远 孟凯 徐怀英 张玉霞 李莉 亓丽红 宋敏训 艾武（山东省农业科学院家禽研究所 山东 济南 250100）



不同白油佐剂制备的H9N2灭活疫苗在SPF鸡上的免疫效果初试验

王友令 袁小远 孟凯 徐怀英 张玉霞 李莉 亓丽红 宋敏训 艾武*（山东省农业科学院家禽研究所 山东 济南 250100）

为了比较不同厂家的注射用矿物白油佐剂的免疫效果，试验采用3个不同黏度的国外白油样品，按照《中华人民共和国兽药典》进行注射用白油质量检验、制备3批H9N2油乳剂灭活疫苗，分别以0.3ml/只剂量，胸部肌肉注射接种28日龄SPF鸡，接种后14d、21d、28d、35d、42d分别进行疫苗的药物残留吸收检查和血清抗体效价检测。结果表明：3种佐剂疫苗的安全性、稳定性均良好；应用WG40白油佐剂的灭活疫苗，免疫SPF鸡产生的H9N2禽流感HI抗体水平优于其它两种佐剂，免疫3周后检测到的H9N2禽流感抗体水平均合格，WG40确定为最佳白油佐剂。

矿物白油佐剂 运动黏度 H9N2 免疫效果

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)感染禽类后引起的一种疾病综合症，包括呼吸道、消化道、产蛋量下降或免疫抑制等疾病，可分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感三类[1]。我国自1994年首次在广东省分离到H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza viruses, H9N2 subtype AIV)以来，H9N2亚型禽流感病毒仍是当前我国鸡群中的主要的低致病性禽流感亚型。H9N2亚型禽流感病毒给我国的养禽业带来了巨大的危害，该病毒不但造成禽呼吸道疾病，还侵害家禽的生殖系统，造成蛋禽产蛋率下降，肉禽生长缓慢，同时易与其他病原微生物混合感染，造成死亡， H9N2亚型禽流感病毒已经有广泛的宿主范围，包括人类、猪以及家禽[2]。最近在中国H7N9高致病性禽流感的暴发导致了多人死亡，其中H7N9毒株的六个内部基因(PA、NS、PB2、PB1、NP、M)均来自H9N2亚型禽流感病毒[3]。此外，有报道称国内猫和犬也易感H9N2亚型禽流感，由于这些物种在发达国家和发展中国家与人类有更亲近的关系，可能会对人的健康造成更大的风险，H9N2亚型禽流感将成为人畜共患传染病毒的储蓄库[4]。预防和控制禽流感最有效的手段就是免疫接种，目前我国用于禽流感H9N2防控的疫苗多为灭活疫苗，所采用的佐剂多数为注射用矿物白油佐剂，油乳剂灭活疫苗由于其具有完整的免疫原性和无毒力返祖现象，并且具有免疫效力高，使用安全，持续时间长等优势，受到了广大养殖户的青睐。因此，注射用矿物白油作为一种佐剂被广泛地应用于禽用灭活疫苗生产中。但不同厂家生产的注射用白油佐剂黏度和纯度等质量不一，因而其应激、免疫吸收和抗体消长效果差异较大，直接影响着疫苗的免疫效果[5,6]。本试验选择3个不同厂家注射用矿物白油佐剂样品，严格按照油乳剂灭活疫苗制造与检验规程标准，进行H9N2灭活疫苗的制备与检验[7]。将检验合格的不同厂家注射用矿物白油佐剂灭活疫苗进行SPF鸡免疫效果试验，对免疫鸡进行采血分离血清检测抗体效价，同时剖检观察注射部位药物吸收、残留情况，通过比较不同厂家注射用矿物白油佐剂的免疫效果差异，为兽医生物制品行业选用合适的矿物白油提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 矿物白油佐剂 不同厂家注射用白油型号分别为WG40、WG50、DDE170，由国内两家不同代理商提供。

1.2 病毒灭活液与标准血清 各项检验合格的鸡H9N2病毒灭活液由山东省农业科学院家禽研究所无特定病原鸡研究室提供。标准H9N2阳性抗原、标准H9N2阳性血清、标准阴性血清由哈尔滨兽医研究所提供。

1.3 培养基和药品 需氧菌培养基、厌氧菌培养基、霉菌培养基等常用培养基由山东省农业科学院家禽研究所制备和保存；吐温-80、司本-80由广州市华南农大生物药品有限公司提供。

1.4 试验材料及设备 28日龄SPF鸡，由山东省农业科学院家禽研究所无特定病原鸡研究室提供。FA25型剪切机，上海弗鲁克公司生产。禽用负压隔离器，苏州安泰公司生产。

1.5 不同厂家注射用矿物白油质量检测 相对密度、运动黏度、稠环芳烃、重金属含量按照《中华人民共和国兽药典》(2010版)的相关规定方法进行检验[8]。

1.6 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗制备与检验 按照油乳剂灭活疫苗的相关规定方法进行制备与检验[9]，每个白油样品制备油乳剂灭活疫苗各250ml。

1.7 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗免疫效果试验 每个白油样品H9N2油乳剂灭活疫苗分别以0.3ml/只剂量，胸部肌肉注射接种28日龄SPF鸡30只，于接种后14d、21d、28d、35d、42d分别无菌采血10只鸡进行血清抗体(HI)效价检测。同时每组扑杀5只鸡进行疫苗的药物残留吸收检查。采用SPSS11.5软件和GraphPad Prism 5软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 注射矿物白油质量检测结果 不同厂家注射用矿物白油质量检测项目与数据结果见表1。

表1 不同厂家注射用矿物白油质量检验结果

由表1可知，对照《中华人民共和国兽药典》的质量标准：运动黏度<7.0的是矿物白油WG40；3种白油稠环芳烃含量吸光度均小于0.10；重金属含量3种白油均<10。

2.2 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗的检验结果 3种注射用矿物白油佐剂配制的H9N2灭活疫苗检验结果：物理性状检验合格；疫苗黏度分别是WG40为1.7s、WG50为2.3s、DDE170为2.5s；无菌检验、安全检验均合格。

2.3 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗免疫 药物吸收、残留剖检结果见表2。

表2 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗胸部肌肉注射药物吸收、残留剖检结果

白油组别14d21d28d35d42d WG402/5+,3/5++5/5+1/5-,4/5+2/5-,3/5+4/5-,1/5+ WG505/5++5/5+3/5-,2/5+4/5-,1/5+4/5-,1/5+ DDE1701/5+,4/5++-1/5,4/5+2/5-,3/5+3/5-,2/5+3/5-,2/5+

注：(-)吸收好无残留物痕迹；(+)药物残留为少量的针尖状的乳白色细小颗粒；(++)药物残留为小米粒样的乳白色颗粒、有绿豆粒大小的肉芽肿1~2 个。

由表2可知，经过5次注射部位剖检检查药物残留情况综合统计，结果其白油佐剂吸收较好的顺序是：WG40>WG50>DDE170。

2.4 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗免疫HI抗体检测结果 将5次血清抗体检测数据经过分析处理，其抗体消长情况见附图。

附图 不同矿物白油H9N2灭活疫苗免疫抗体消长曲线

由附图可知：不同矿物白油样品H9N2灭活疫苗抗体监测平均值比较发现，WG40在接种后14d、21d、28d、35d、42d的抗体均比WG50和DDE170高，且抗体上升快。而WG50和DDE170组在整个免疫期抗体差异不大，从抗体水平看，WG40白油适合用于H9N2油乳剂疫苗的佐剂。

3 讨论

（1）免疫佐剂是指与抗原同时或先于抗原使用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的物质[10]。选择佐剂时不仅要考虑其免疫促进作用，也要兼顾佐剂的安全性及佐剂与抗原适当比例配制后疫苗的黏度、稳定性等是否符合要求。目前，灭活疫苗尤其是禽用灭活疫苗，通常使用的佐剂是矿物油佐剂，抗体滴度维持时间较长。但是，不同油佐剂对疫苗免疫效果的增强作用可能存在差异[11]。矿物白油佐剂在兽用灭活疫苗上的应用研究开始于上世纪80年代，对预防控制畜禽重大疫病的传播起到重要作用[12]。注射用矿物白油，其配制的灭活疫苗的共性问题是：如果注射用矿物白油的运动黏度系数高，则制备的灭活疫苗在免疫注射过程中出现黏稠度较大、注射困难、毒副反应较强(过敏)、引起注射部位红肿、化脓、吸收慢、残留量高，导致免疫动物生产和生长发育性能显著下降等现象；运动黏度系数过低，则制备的灭活疫苗在免疫注射过程中出现黏稠度较小、吸收过快、毒副反应较强(过敏)，黏度过高过低均会引起大的应激问题，其本质与矿物白油佐剂的内在质量相关[13]。（2）本试验选择了3种进口油佐剂，与禽流感( H9N2亚型) 病毒液配制成灭活疫苗，免疫接种28日龄的SPF鸡均未出现局部肿块及不良反应，说明3 种佐剂的生物兼容性较好，易吸收，无毒副作用。通过对这3种注射用矿物白油样品质量监测数据、抗体消长数据、药物吸收及残留量检测等结果综合分析，表明，影响免疫效果的是注射用矿物白油的运动黏度、稠环芳烃含量、重金属含量等综合因素。根据本试验研究的3种进口油佐剂配制的禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗免疫28日龄SPF鸡的效力检验结果表明，不同佐剂制备的灭活疫苗的抗体效价确实存在明显差异，只有WG40作为佐剂的疫苗，免疫后2周H9N2流感病毒的抗体达到合格水平，其余佐剂则在免疫3周后才能达到合格水平。分析原因，这可能与其运动黏度较低，抗原能够短时间释放有一定的关系。试验结果认为WG40白油可以作为30日龄左右育成鸡的禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗的理想佐剂，但是以WG40为佐剂的禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗在产蛋禽上的实际应用效果有待进一步试验验证。

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（2017–09–28）

畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发(2016YFD0501600)；山东省2015年度农业重大应用技术创新项目(肉鸭疫病监测和防治技术集成与示范)；山东省中标禽流感疫苗质量检测项目。

S859.79+7

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1007-1733(2018)02-0003-03