参松养心胶囊对心肌梗死大鼠心肌细胞的保护作用

张敬 冯红兵 李君 罗长军 熊小奇

[摘要]目的探究参松养心胶囊对心肌梗死模型大鼠心肌细胞的保护作用及其可能的机制研究。方法

采用冠状动脉前降支结扎术建立心肌梗死模型。将60只SD大鼠随机分为梗死组与非梗死组，非梗死组采取开胸后冠状动脉穿线，但不做结扎。模型制作成功后，将两组随机平分为对照组10只，美托洛尔组10只，参松养心胶囊组10只，术后分别以普食、普食+美托洛尔、普食+参松养心胶囊原粉喂食。8周后处理大鼠，取心肌梗死周围组织，检测各组大鼠心肌缝隙连接蛋白（Cx43）和信使RNA（rnRNA）的表达量。结果在非梗死各组中Cx43蛋白表达强烈，且均匀的分布在细胞与细胞之间的连接处；与非梗死组比较，梗死组的对照组Cx43表达明显减弱，甚至全部消失，而参松养心胶囊组及美托洛尔组梗死区的Cx43表达减弱和分布的紊乱弥散程度均较小；非梗死各组的蛋白和mRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；在梗死组中，对照组Cx43蛋白和mRNA表达明显低于参松养心胶囊组及美托洛尔组（P<0.05），但参松养心胶囊组与美托洛尔组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论参松养心胶囊能够显著改善大鼠心肌梗死后Cx43的表达，可能与其报道中能改善心肌梗死后心律失常和心功能不全有关。

[关键词]心肌梗死；参松养心胶囊；美托洛尔；缝隙连接蛋白

心肌梗死是临床上常见的心脏疾病，多数患者常常会伴有心率失常，严重者会出现心室颤动进而导致猝死。因此心脏梗死严重影响患者的生活质量，危害生命。但是目前临床上常见的抗心律失常的药物在改善患者心律失常的同时，会出现很多并发症导致死亡率的增加。因此寻找一种能够改善患者心律失常同时，增强疗效，改善患者预后，减少患者的死亡率的药物至关重要。参松养心胶囊由五味子、麦冬、丹参、黄连等多种中药组成的复方剂。有研究发现，参松养心胶囊能够通过抑制离子通道来改善心律失常，并且预后良好，减少了病死率和死亡率。但是具体的作用机制尚不清楚。近年来的研究发现，缝隙连接蛋白43（eonnexin43，Cx43）在室性心律失常发生中发挥着重要作用。因此本文建立心肌梗死的模型来研究参松养心胶囊治疗对Cx43表达的影响及可能的机制。

1材料与方法

1.1材料：雄性SD大鼠60只，体重250～300g，由广西医科大学实验动物中心提供。Cx43单克隆抗体和辣根酶标记二抗购自美国Abcaln公司；DAB显色试剂盒，苏木素购自北京中杉金桥公司；Trizol Reagent购自Invit.mgen公司，逆转录试剂盒和扩增试剂盒均购自ThermoFisher Scientific公司，参松养心胶囊购自北京以岭药业有限公司（国药准字Z20103032，产品批号20160781），酒石酸美托洛尔片购自阿斯利康制药有限公司（国药准字H32025392，产品批号20153302L）。

1.2动物模型的建立及分组：取60只sD大鼠，随机分为非心肌梗死组30只与心肌梗死组30只。梗死组以戊巴比妥（30mg/kg）耳缘静脉麻醉后，经前胸暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支。非梗死组采取假手术，以戊巴比妥（30me_/kg）麻醉后，经前胸暴露心脏后在冠状动脉下穿线，但不结扎。以心电监护检测显示I、Ⅱ、aVL导联sT段抬高0.2mv以模型建造成功的标准。造模成功后，将梗死组与非梗死组分别随机分为三组（分别为对照组10只，美托洛尔组10只，参松养心胶囊组10只），各以普食（对照组），普食+美托洛尔（美托洛尔剂量0.5g/kg·d），普食+参松养心胶囊（参松养心胶囊原粉0.8g/kg·d）喂养8周后，处死动物，取心肌梗死周围组织。

1.3观察指标：

1.3.1心肌细胞中Cx43的检测：将取出的心脏组织经4%多聚甲醛固定，常规脱水，包埋后连续切片，切片厚度控制在4t_tm，采用免疫组织化学sP法检测心脏心肌细胞中Cx43的表达。染色步骤严格参照试剂盒说明书。一抗Cx43（1：300）4℃过夜，DAB染色，苏木素复染，分化。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为实验的阴性对照。在400倍镜下随机选取6个视野，用Image J软件分析图片的平均阳性表达面积与积分光密度值。

1.3.2 western blot技术方法检测心肌细胞中Cx43蛋白的表达：取心脏组织，按照RAPI裂解液说明书提取细胞中的总蛋白。考马斯亮蓝法对总蛋白进行定量。取30μg总蛋白采用10%SDS-PAGE分离蛋白，电泳1.5小时后转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1h，加鼠抗Cx43单克隆抗体（1：2000）4℃过夜，PBS清洗后加入二抗[IgG1：2000）]，37℃孵育2h，最后电化学发光显影后用凝胶成像分析系统（Bio-Rad，USA）测蛋白条带光密度值。本实验选用GAPDH作为内参对照。以Cx43与GAPDH蛋白的光密度值的比值作為Cx43的相对表达量。

1.3.3 RT-PCR技术方法检测心肌细胞中Cx43mRNA的表达：取心脏组织，采用Trizol试剂一步法提取细胞中的RNA，严格按照逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒说明书操作，将细胞RNA反转录成eDNA，然后扩增成DNA。

1.4统计学处理：采用SPSS22.0版数据分析软件对数据进行统计分析，方差分析比较组间差异性，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1一般情况：各组动物均无死亡、饮食异常和腹泻等情况，按原定计划后处死取目标组织。

2.2 Cx43免疫组化染色结果：在非梗死组，各组Cx43蛋白表达强烈，且均匀的分布在细胞与细胞之间的连接处。可见它们呈棕黄色颗粒状表达，主要位于闰盘内，成线状排列，与细胞长轴方向垂直。与之比较，在各梗死组Cx43表达明显减弱且分布紊乱。尤其在梗死组，对照组的Cx43表达明显减弱，甚至全部消失，而参松养心胶囊组及美托洛尔组梗死区的Cx43表达减弱和分布的紊乱弥散程度均较小（图1、图2见封三）。

2.3 Cx43免疫组化结果分析：图象定量分析显示在梗死组，与对照组相比，参松养心胶囊组和美托洛尔组Cx43阳性表达面积明显升高（2532.70±282.70）vs（1421.70±326.50）（P<0.05）和（2842.50±336.50）vs（1421.70±326.50）（P<0.05）。同样两组测定的积分光密度值也明显高于对照组（399.24±66.54）vs（223.74±42.15）（P<0.05）和（436.74±78.29）vs（223.74±42.15）（P<0.05）。但参松养心胶囊组与美托洛尔组之间差异无统计学意义。图象定量分析显示在非梗死组，三者之间的Cx43阳性表达面积和积分光密度值差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 Western blot结果分析：在非梗死组各组的蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。在梗死组中对照组Cx43表达明显低于参松养心胶囊组及美托洛尔组（0.31±0.12）units vs（1.50±0.21）units（P<0.05）和（0.31±0.12）units vs（1.39±0.16）units（P<0.05），但参松养心胶囊组与美托洛尔组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

2.5RT-PCR结果分析：在非梗死组，各组的Cx43mRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。但在梗死组中对照组Cx43mRNA表达明显低于参松养心胶囊组及美托洛尔组（0.29±0.09）units vs（0.56+0.12）units（P<0.05）和（0.29+0.09）units vs（0.57±0.14）tmits（P<0.05），而参松养心胶囊组与美托洛尔组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

Cx43是心室肌缝隙连接通道的主要构成成分，参与着细胞间的信号传导。有研究发现，心肌梗死后心肌细胞中的连接蛋白Cx43会发生数量，分布等方面的显著改变。在Peter等的研究中报道，在构建的心肌梗死的犬模型中发现心外膜梗死边缘区的心肌细胞的Cx43数量显著降低，而且分布也发生了显著的变化；而在离心肌梗死稍远区的心肌细胞的Cx43分布未见明显变化，但是其数量却又显著地降低。而本研究结果显示在非梗死组，各组Cx43蛋白表达强烈，且均匀地分布在细胞与细胞之间的连接处。可见他们呈棕黄色颗粒状表达，主要位于闰盘内，成线状排列，与细胞长轴方向垂直。与之比较，在梗死组各组Cx43表达明显减弱且分布紊乱。尤其在对照组，梗死区的Cx43表达明显减弱，甚至全部消失，而参松养心胶囊组及美托洛尔组梗死区的Cx43表达减弱和分布的紊乱弥散程度均较小，与国内外的研究报道一致。

Cx43是构成心室肌细胞间缝隙连接（gap june.tion，GJ）通道最主要的蛋白，也是心室肌细胞间电流传导的主要导体。有研究报道，缝隙连接的连接蛋白43是冠状动脉阻塞后心肌梗死范围大小的最主要的决定因素之一。而本研究结果发现梗死组的Cx43蛋白的表达明显高于非梗死组，经美托洛尔和参松养心胶囊药物干预后，心肌细胞中Cx43蛋白的表达出现了明显的降低。在梗死组，与对照组相比，参松养心胶囊组和美托洛尔组Cx43阳性表达面积明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。同样两组测定的积分光密度值也明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。但参松养心胶囊组与美托洛尔组之间差异无统计学意义（P<0.05）。而在非梗死组，三者之间的Cx43阳性表达面积和积分光密度值差异无统计学意义。提示美托洛尔与参松养心胶囊两药均能改善心肌梗死后心律失常和心功能不全。

Lindsey等的研究报道在心肌梗死的小鼠模型的心肌连接蛋白Cx43的阳性表达面积明显减少，而且Cx43蛋白的表达水平也比对照组有明显的降低，但是Cx43rnRNA的表达却未见明显的改变。本研究结构显示，与对照组相比，SD大鼠心肌梗死模型中心肌連接蛋白Cx43的阳性表达和Cx43mRNA，蛋白的表达均出现了明显的改变（P<0.05），该结果与Amino等的研究一致，在大鼠心肌梗死后心肌连接蛋白Cx43的分布与mRNA和蛋白的水平明显减少（P<0.05），提示心肌细胞梗死后心肌连接蛋白发生了重构现象。在经美托洛尔和参松养心胶囊药物治疗后，心肌细胞中的心肌连接蛋白的mRNA和蛋白的水平出现了明显的升高，提示美托洛尔和参松养心胶囊两药均能够通过调节心肌连接蛋白Cx43的表达来发挥改善心肌梗死后心脏重构的作用。但是与美托洛尔相比，参松养心胶囊对Cx43的调节差异无统计学意义（P>0.05）。

因此，通过上述实验结果可推断，参松养心胶囊能够通过调节心肌细胞中心肌连接蛋白Cx43的表达来延缓心肌梗死后心脏重构的病理变化，其作用和美托洛尔相当。但是关于具体的作用机制尚不清楚，有待进一步的研究。