番茄红素对2型糖尿病肾脏的保护作用及其机制研究

王芳 张萍 韩娟 马佳佳

【摘要】目的：研究番茄红素对实验性糖尿病小鼠肾脏的氧化应激损伤的保护作用。方法：采用高能量饲料加链脲佐菌素制备2型糖尿病小鼠模型。建模成功后，实验组分别给予口服灌胃40mg/kg和80mg/kg剂量的番茄红素，每周5次，连续治疗8周。第8周后剪尾采血测定血糖值变化。腹主动脉取血分离血清。分别用试剂盒测定SOD、GSH-Px以及24h尿蛋白的含量。H&E染色观察肾脏组织病理形态的变化，RT-PCR法检测肾组织中血红素氧合酶一1（HO-1） mRNA的表达。结果：与正常对照组相比糖尿病模型组尿蛋白含量显著上升，SOD和GSH-Px含量明显减少，而经过番茄红素治疗后，SOD和GSH-Px的含量明显提升，病理学形态也明顯得到改善。结论：番茄红素能降低糖尿病小鼠动物模型的尿蛋白，改善肾脏功能，减轻肾组织的病理损伤，增强HO-1 mRNA的表达水平，可减缓糖尿病早期的肾损伤。

【关键词】番茄红素;糖尿病;血红色氧合酶一1;肾损伤

糖尿病肾病是糖尿病最常见的慢性并发症之一，也是糖尿病患者致死、致残的主要原因之一[1]。以往的研究认为，实验性糖尿病的发病与氧自由基反应增加和氧自由基酶类活性降低有密切关系[2]，同时发现血红素氧合酶一l （heme oxygenase-l，HO-I）具有抗感染、抗氧化、抗凋亡及抗增生效应。有研究报道HO-1上可以被多种因素诱导表达，提示HO-1可能作为一种自我保护因子被刺激分泌。番茄红素是一种具有13个双键的直链烃化物，属于类胡萝卜素，广泛存在于番茄、胡萝卜等红色蔬菜和水果中。大量的研究表明，番茄红素具有抗氧化性、降血脂、抗肿瘤、保护心血管、增强机体免疫力等多种生物学效应[3]。本研究主要采用高脂、高糖和链脲佐菌素（STZ）方式制备2型糖尿病小鼠模型，研究番茄红素对2型糖尿病肾病的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

I.l.l 实验动物

健康的雄性C57BL/6J小鼠60只，体重18-22g，购自西安交通大学实验动物中心，生产许可证号【SYXK（陕）2014-003】;动物饲养在西安交通大学实验动物中心SPF动物实验室，使用许可证号：【SYXK（陕）2015-002】。垫料采用灭菌杨树木刨花垫料，饲料为钴源照射处理的全价颗粒饲料，饮水为高压灭菌的无菌水，光照周期为12h/12h。动物实验和饲养条件严格按照SPF动物的规范要求进行操作。

1.1.2 主要试剂盒仪器

链脲佐菌素（STZ）购自sigma公司;谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX）测定试剂盒（比色法）（货号：A005）;总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（WST-I法）（货号：A001-3）;尿蛋白定量测试盒（CBB法）（货号：C035-2）均购自南京建成生物工程研究所;罗氏血糖仪及试纸条通过剪尾取血测定血糖浓度;总RNA提取试剂盒购自QIAGEN（货号：DP431）。

2 方法

2.1 糖尿病动物模型的筛选及分组

C57BL/6J小鼠60只，适应性饲养3天后，60%热量的高脂饲料饲养4w后，空腹12h，使用pH4.5，50mM的柠檬酸缓冲液配置SZT，使其终浓度为4mg/ml[4]。每只动物按40mg/kg腹腔注射SZT。饮水替换为10%蔗糖水。此后4天，每天给予同样处理，由于STZ容易降解，每次使用需新鲜配制。第6天开始，撤掉蔗糖给予正常无菌水饲养。48h后尾静脉采血测定血糖值，血糖值大于ll.lmmol/L的选为实验对象[4]，随机分为糖尿病组，番茄红素40mg/kg组合番茄红素80mg/kg组。其余动物淘汰处理。由于番茄红素不溶于水，选用25%聚氧乙烯蓖麻油作为增溶剂溶解番茄红素，分别配置番茄红素两个不同剂量进行口服灌胃治疗。糖尿病组和正常对照组采用25%聚氧乙烯蓖麻油灌胃。连续治疗8W后进行检测。

2.2 尿蛋白浓度和血糖的测定

将番茄红素干预末期的各组动物转移至代谢笼内饲养24h，收集尿液。并通过尿蛋白定量测试盒（CBB法）测定动物的尿蛋白含量。血糖测定前，各组动物空腹12h后，通过剪尾取血的方式，利用罗氏血糖仪剪尾采血测定血糖值并记录。

2.3 氧化应激指标的测定与观察

氧化应激是体内活性氧化物质的产生和抗氧化防御体系之间失衡所致的损伤。糖尿病存在明显的氧化应激。SOD和GSH-Px是人体氧化酶促反应中主要的两种酶，在维持体内的氧化抗氧化动态平衡和免疫动态平衡中发挥重要的作用。利用谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX）测定试剂盒和总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒。

2.4 肾组织的病理形态观察

小鼠颈椎脱臼处死后，摘取一侧肾脏，4%多聚甲醛固定，室温保存72h后切片，H&E染色。显微镜下观察糖尿病模型的肾损伤和番茄红素对肾脏的保护修复效果。2.5肾脏组织中HO-1表达的测定

取新鲜的肾脏组织lOOmg液氮处理，加Iml的Trizol裂解并研磨。按照总RNA提取试剂盒提取小鼠总RNA。QIAGEN的Total RNA抽提试剂盒抽提组织中的总RNA。测定RNA浓度和纯度后逆转录成cDNA，设计HO-I引物：HO-1-F：AGGTACACATCCAAGCCGAGA; HO-1-R： CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT;p-actin-F： GGCTGTATTCCCCTCCATCG;p-actin-R： CCAGTTGGTAACAATGCCATGT。扩增产物1.6%琼脂糖核酸电泳，凝胶成像仪成像并分析，ImageJ进行灰度扫描，计算HO-1基因的相对表达含量。

3 结果

3.1 番茄红素能对有效控制糖尿病动物的尿蛋白和血糖

经过8周的资番茄红素治疗后，各组动物饲养在代谢笼中，收集24h的尿液。通过CBB法，按照试剂盒说明书测定各组小鼠的尿蛋白含量。同时，尾静脉采血测定经番茄红素治疗后各组动物的血糖值（图1）。

3.2 番茄红素能改善糖尿病模型动物的氧化应激水平

与正常阴性对照组相比较，糖尿病动物模型的SOD和GSH-Px的含量明显被抑制。随着血清番茄红素水平的增加，血清中SOD和GSH-Px含量升高。机体抗氧化能力得到了显著提升。有效保护糖尿病肾损伤（图2）。

3.3 番茄红素能改善糖尿病动物肾脏的病理损伤

STZ诱导的糖尿病模型鼠肾脏出现典型的肾小球损伤，如肾小球硬化，细胞空泡化，基底膜增生以及炎性细胞浸润等病例表现。而经过番茄红素的干预后，损伤得到一定的控制。形态学也反映出细胞损伤减轻、细胞坏死减少，炎性细胞亲润减轻并对肾基底膜进行有效的修复（图3）。

3.4 番茄紅素通过上调HO-1在糖尿病肾脏中的表达对肾脏发挥保护作用

与正常的阴性对照小鼠比较，未进行干预的糖尿病模型组小鼠的HO-I水平被显著抑制。而通过连续的给予番茄红素干预后，肾脏组织HO-1的mRNA水平得到了有效提升，证实番茄红素对糖尿病肾损伤的保护主要是通过抗氧化的机制来实现修复了（图4）。

4 讨论

糖尿病是一种具有遗传特征性的慢性内分泌代谢系统疾病.随着饮食结构及生活习惯的改变，糖尿病的发病率逐年上升，严重危害人们的生活质量。长期血糖控制不佳的糖尿病患者往往伴有多器官组织的并发症，是糖尿病患者致残、甚至致死的主要原因。随着病理生理学研究的不断深入，发现糖脂代谢异常而导致的氧自由基过剩，以及所引发的氧化应激损伤是糖尿病损伤及其并发症发生发展的共同通路之一。糖尿病主要表现为高血糖症，是血液中过量的葡萄糖引起的代谢障碍。当长期出现这种症状，血糖应激会导致脏器病理改变，如糖尿病肾损伤研究发现在糖尿病病程发展早期，SOD含量升高，说明肾脏局部存在氧化应激反应及超氧化物的过度产生，进而引发糖尿病肾损伤[5，6]。

氧化应激是体内活性氧产生和抗氧化防御体系之间失衡而导致组织损伤的一种状态。大量的研究表明，糖尿存在明显的氧化应激，并且氧化应激与糖尿病各种慢性病并发症主要发病机制几乎均有相关性[7]。机体抗氧化损伤防御体系包括酶促和非酶促体系两部分，通过消除自由基和活性氧，分解过氧化物，除去起催化作用的金属离子等功能来维护机体健康。SOD，GSH-Px是机体抗氧化酶促系统中主要的两种酶，SOD能够提供氢原子配体进而催化还原氧自由基生成过氧化氢，并且在GSH-Px催化作用下进一步还原生成对人体无害的水和氧气。在临床检测中，尿蛋白含量能够反映肾功能受损伤的程度[9]。本研究结果也证实，糖尿病肾损伤的小鼠体内SOD和GSH-Px含量减少，而用抗氧化效果明显的番茄红素治疗后，SOD、GSH-Px的含量显著增多。在我们的实验中，STZ诱导的糖尿病小鼠尿液中蛋白含量增加，番茄红素的抗氧化治疗能有效的控制并减少尿蛋白含量。番茄红素的抗氧化能力可以通过增加SOD，GSH-Px的活力，从而提高机体抗氧化系统能力，降低对毒物的敏感性[10]。此外，HO-1作为一种重要的血红素分解代谢酶，能催化血红素生成胆绿素。并能够异化游离血红素为CO，正常水平的CO能通过调节IL-10/1R通路介导抗炎的特性[11，12]，而STZ诱导的糖尿病小鼠模型伴有内源性的肾氧化应激使得HO-1的mRNA维持在较低水平。但番茄红素有效的改善了肾脏的抗氧化活性，我们推测HO-1的表达与增强机体的抗氧化能力具有潜在的相关性，通过HO-1的表达维持肾脏代谢的稳定性。

参考文献

[1] Gueut in V，Gauthier M，CazenaveM， et al. Diabetic nephropathy：emerging treatments. NephrolTher， 2014，10 （04）： 210-5.

[2] Fraser ML， Lee AH， Binns CW.Lycopene and prostate cancer：emerging evidence. Expert RevAnticancer

The r. 2005;5 （05）： 847- 54。

[3]Li W，Wang G，Lu X，et al. Lycopeneameliorates renal functionin rats with streptozotocin-induceddiabetes. Int J Clin ExpPathol. 2014;7 （08）： 5008-15.

[4]K.Wu， T. Liang，X.Duan，e tal.Antidiabetic effectsof puerarin， isolated fromPueraria lobata （Willd.），onstreptozotocin-diabetogenicmice through promoting insulinexpression and amelioratingMetabolic function，Food Chem.Toxicol， 2013， 60， 341-347.

[5]P. Bjorns tad，D. Cherney，D.M.Maahs，Early diabetic nephropathy intype l diabetes： new insights，Curr. Opin. Endocrinol. ， DiabetesObes.， 2014， 21， 279-286.

[6] Anbar HS， Shehatou GS， Suddek GM，et al.Comparison of the effectsof levocetirizine and losartan ondiabetic nephropathy and vasculardysfunction in streptozotocin-induced diabeticrats. Eur JPharmacol. 2016; 780： 82-92.

[7] Brownlee M. The pathobiologyof diabetic complications： aunifying mechanism. Diabetes，2005Jun; 54 （06）：1615-25.

[8] A. Djordjevic， S. Spasic， A.Jovanovic-Galovic， et al. Oxidativestress in diabetic pregnancy：SOD，CAT and GSH-Px activity and lipidperoxida tion

produc t s， J. Ma tern. -Fetal Neona t. Med. ， 2004， 16， 367-372.

[9] J. Y. Guh，Proteinuria versusalbuminuria in chronic kidney disease， Nephrology， 2 01 0， 15， 5 3-56.

[10] Rodriguez MP， Emond ZM， WangZ， et al. Role of Metabolicenvironment on nitric oxidemediated inhibition of neointimalhyperplasia in type l and type 2diabetes. Nitric Oxide. 2014 Jan30， 36： 67-75.

[11] R. Gozzelino， V. Jeney， M.P. Soares，Mechanisms of cellprotection by heme oxygenase-1， Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol.， 2010， 50， 323-354.

[12] P. Mandal， M. T. Pritchard， L. E.Nagy，Antiinflammatory pathwaysand alcoholic liver disease： roleof an adiponectin/interleukin-10/heme oxygenase-l pathway， World J.Ga s troenterol. ， 2010， 16， 1330-1 336.