旱稻Tail－PCR技术主要影响因素的优化和验证

朱 昀，李朝炜，刘嗣凡，刘 颖，魏景芳

(河北科技大学，河北石家庄050018)

热不对称交错PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR，Tail－PCR)是一种分离已知DNA序列旁侧未知序列的分子生物学技术。该方法通过不同特异引物与简并引物的组合，进行3轮PCR扩增，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的特殊热循环程序，达到特异产物扩增的同时抑制由随机引物产生的非特异扩增的目的［1］。该方法简单易行，能够在较短的时间内获得目标片段，产物特异性高，结果较为稳定［2］。目前，采用此方法已成功对大豆、棉花、小麦、油菜、红豆杉、天山雪莲、拟南芥等植物已知序列的侧翼序列进行了分析［3-8］。

为了对已获得的大量转基因旱稻纯合体株系进行插入位点旁侧序列分析，本研究以转基因旱稻为材料，参考前人成功经验，结合河北科技大学生物技术实验室的实际情况，对Tail－PCR方法进行探索改进和优化，旨在为转基因旱稻的研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

转基因T3代旱稻由河北科技大学生物技术实验室通过农杆菌侵染法获得［9-11］，通过Southern blot分析确定外源基因为单拷贝［12］。侵染所用质粒为改造的pCAMBIA3301。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 采用改良的 CTAB 法［13］对旱稻基因组进行提取，略加改动。剪取转基因植株叶片0.2 g，放于2 mL装有小钢珠的离心管中，迅速置于液氮中冷冻2 min，在研磨机上进行研磨;叶片研成粉末后，向每个离心管中加入600 μL提取液［CTAB 3%(m/V)，NaCl 1.4 mol/L，EDTA(pH 值 8.0)20 mmol/L，Tris－HCl(pH 值 8.0)100 mmol/L，β－巯基乙醇0.2%(m/V)］，混匀后放于65℃水浴锅中水浴30 min，期间轻柔摇晃数次;将小钢珠从离心管中取出，12 000 r/min离心15 min;取上清……