KP对早期胎盘滋养层细胞迁移及细胞内ERK、MMP-9、VEGF表达的影响

孙新六

(泰安市中心医院，山东泰安271000)

胎盘形成过程中，绒毛膜滋养层细胞对子宫壁不断重塑，侵入母体子宫内壁蜕膜，改造子宫壁螺旋动脉，形成丰富的血管通道，使母体和胎儿间有足够营养和气体交换[1]。人黑色素转移抑制基因(KP)与胎盘形成有关。绒毛膜滋养层细胞有KP和抗人黑色素转移抑制基因蛋白受体(GPR54)表达，KP与GPR54结合能影响癌细胞的生长、转移，并调节生殖功能、影响内分泌[2]。基质金属蛋白酶(MMP)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)在绒毛膜滋养层细胞对子宫内壁的入侵过程中发挥重要作用[3]。2016年3月～2017年5月，本研究探讨了KP对早期胎盘滋养层细胞迁移及细胞外调节蛋白激酶(ERK)、MMP-9、VEGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 胎盘及试剂来源 胎盘来自本院自愿终止妊娠者[妊娠<3个月、年龄(27.6±5.8)岁，均为初孕，孕周(8.6±1.2)周，均知情同意]。鼠源GPR54抗体、鼠源抗人KP抗体、鼠源抗人β-actin抗体均购于BOSTER公司。KP抑制剂P234购于美国Abcam公司。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 滋养层细胞分离、培养及分组 取胎盘，无菌状态下剪取胎盘绒毛膜组织，用预先冰冷的PBS液漂洗3次，用眼科镊子剪成碎块，在含有0.25%胰蛋白酶和DNA酶(200 U/mL)溶液中37 ℃消化3次，30 min/次，收集悬浮细胞，去组织块，PBS液漂洗2次，以Percoll液梯度离心(3 000 r/min，20 min)分离细胞。将细胞收集于培养皿中，用RPMI1640液培养1 h，巨噬细胞贴壁，悬浮细胞，接种于24孔板，用含10%胎牛血清、1%青霉素与链霉素的RPMI1640培养液于37 ℃、5%CO2环境中培养，培养48 h。将滋养层细胞随机分为三组，对照组常规培养，KP组加入终浓度为100 nmol/L KP蛋白进行培养，KP+P234组加入终浓度为100 nmol/L KP蛋白及其抑制剂P234(终浓度5 μmol/L)进行培养，均培养30 min。

1.3 滋养层细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。收集三组细胞，于6孔板中生长融合后，以吸头轻轻划痕，无菌PBS液轻柔冲去划痕中散落的细胞，于37 ℃、5% CO2环境中培养48 h。于显微镜下分别测量0、48 h划痕的宽度，计算迁移率。细胞迁移率=48 h划痕两边缘距离减小值/0 h划痕两边缘距离×100%，对照组迁移率为1。

1.4 细胞内KP、GPR54、MMP-9、VEGF mRNA表达检测 采用荧光定量PCR法。取各组细胞，采用TRIzol液常规提取细胞总RNA，将RNA逆转录成cDNA。反应产物进行荧光定量PCR。KP正向引物：5′-CTCACTGGTTTCTTGGCAGCTAC-3′、反向引物：5′-AGAGCCTACCCAGATGCTGAG-3′；GPR54正向引物：5′-GCTGGTACGTGAC GGTGTTC-3′、反向引物：5′-AGAGCCTACCCAGATGCTGAG-3′；MMP-9正向引物：5′-TGGAGGTTCGACGTGAAGG-3′、反向引物：5′-AAATAGGCTTTC TCTCGGTACTGG-3′；VEGF正向引物：5′-ACATCTTCAAGCCATCCTGTGTG-3′、反向引物:5′-TGGCCGTTGAGGTTGGAATG-3′。反应条件：95 ℃变性15 s，60 ℃复性和延伸40 s，40个循环。同时扩增内参β-actin。以2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.5 细胞内ERK蛋白表达检测 收集三组细胞，SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，Western blotting法检测ERK和磷酸化的ERK(p-EKR)，实验组蛋白相对表达量=p-ERK/ERK。

2 结果

2.1 三组滋养细胞迁移能力比较 对照组细胞迁移率为1，KP组为55.9%，KP+P234组为81.8%，三组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 三组KP、GPR54、MMP-9、VEGF mRNA表达比较 对照组KP、GPR54、MMP-9、VEGF mRNA相对表达量均为1，KP组分别为1.05±0.03、1.03±0.02、0.36±0.10、0.48±0.13，KP±P234组分别为0.58±0.12、1.04±0.06、0.62±0.15、0.85±0.17。KP组KP mRNA相对表达量较KP+234组高(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；三组GPR54 mRNA相对表达量比较，P均>0.05；与对照组比较，KP组、KP±P234组MMP-9、VEGF mRNA相对表达量低(P均<0.05)，KP组最低(P均<0.05)。

2.3 三组ERK蛋白表达比较 对照组p-ERK/ERK为1，KP组为2.3±0.5，KP+P234组为1.6±0.3，与对照组比较，KP组、KP±P234组ERK蛋白相对表达量低(P均<0.05)，KP组最低(P均<0.05)。

3 讨论

KP结合G蛋白受体GPR54，可激活磷脂酶C，导致细胞内钙离子增加。KP能激活细胞中的ERK信号通路，使细胞永生化[4]。KP和GPR54最初均表达于受精卵合胞体细胞，与胎盘的形成有关；胎盘形成过程失调可致多种孕期并发症[5]，如滋养层细胞入侵贫乏可致患者出现子痫前期症状、胎儿宫内生长受限；胎盘形成过度入侵则致胎盘异常增生[6]。绒毛膜滋养层细胞有KP和GPR54表达[7]。KP的转录表达在早期和末期胎盘中无差异；但GPR54在早期胎盘的表达高于末期胎盘[8]。这与怀孕早期滋养层细胞高侵入性而末期胎盘低侵入性相一致。本研究结果表明，早期胎盘滋养层细胞均表达GPR54、KP，提示GRP54、KP与早期胎盘的发育可能相关。

绒毛膜滋养层细胞对入侵血管的过程与肿瘤细胞相似，MMP、VEGF在其中发挥重要作用[9]。本研究结果显示，KP可抑制滋养层细胞迁移，影响子宫内壁的重塑。KP干预后，滋养层细胞ERK蛋白表达降低，加入KP抑制剂P234则ERK蛋白表达高。其作用机制可能为KP与其受体GPR54结合后，激活磷脂酶C，使二磷酸磷脂酰肌醇水解，产生细胞内第二信使三磷酸肌醇和甘油二酯，使细胞内钙离子增加，磷酸化ERK，从而产生生物学作用[10]。提示KP能刺激ERK磷酸化从而抑制ERK介导的细胞信号通路发挥作用。

MMP能降解细胞外基底膜，在绒毛膜滋养层细胞对螺旋动脉的重塑过程中起重要作用。MMP-9表达减少时，滋养层细胞入侵能力减弱，胎盘形成不良，易诱发子痫前期症状及胎儿宫内生长受限[11]。KP可控制MMP-9活性，其可能通过调节MMP的转录而发挥抑制作用。滋养层细胞入侵子宫内膜，通过替换血管内皮细胞，转化子宫内壁血管[12]。本研究结果显示，KP能降低滋养细胞内MMP-9、VEGF mRNA表达，提示MMP-9和VEGF参与胎盘形成过程。

综上所述，KP可抑制早期胎盘滋养层细胞迁移，抑制细胞内ERK、MMP-9及VEGF表达。

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