猕猴肠道菌群基因组DNA提取及其ERIC-PCR分析

张蒙

（凉山州农业学校，四川 西昌 615000）

由于猕猴在形态学、生殖生理特性和生化代谢方面与人类非常相似，在医学和生物学领域早已被作为理想的实验动物。本试验通过采集3个不同年龄段（幼年、青年、老年）猕猴的粪便样本，提取其中的微生物总DNA，并应用ERIC-PCR技术对3种粪便中的菌群结构差异及相关性进行分析，为进一步研究肠道菌群与猕猴营养、消化和吸收的关系奠定基础。

1 材料与方法

1 材料

1.1.1 粪便样品 从国家实验猕猴基地采集老年（2只）、青年（2只）和幼年（2只）猕猴的新鲜粪便各2份。1.1.2 主要仪器 台式离心机，分光光度计，核酸蛋白检测仪，PCR扩增仪，BIO-RAD凝胶成像系统，FR-180A电泳槽，电热恒温水浴锅。

1.1.3 主要试剂 无菌PBS缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.4），TE buffer，丙酮，含溶菌酶的TE（溶菌酶浓度20mg/mL），消化缓冲液，无水乙醇，蛋白酶K，洗液，洗脱缓冲液，10×Buffer，dNTP，上下游引物，TaqDNA聚合酶，DNA模板，双蒸水，MgCl2。

2 试验方法

2.1 粪便采集 采集3个年龄段猕猴的粪便各2份，每份标本湿重约4g，收集到无菌塑料袋置于冰盒中，迅速带入实验室-20℃保存备用。

2.2 粪便标本预处理 将每份粪便标本分成均匀的3份，分别加入装有6 mL无菌PBS缓冲液的试管中，充分振荡5～10min，500r/min离心5 min，收集上清液。此步骤重复3次。然后取上清液以5000 r/min离心10min，收集沉淀置于Eppendorf管中。沉淀物在1mL TE buffer中悬置，混合后以14 000 r/min离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μL丙酮中（-20℃预冷），振荡混匀，14000r/min离心2min，弃上清。此步骤重复3次。最后将细菌溶于TE buffer中，混匀，分别标上记号，-20℃保存备用。

2.3 细菌基因组提取

2.3.1 反复冻融法[1]在预处理好的样品中加入660 μL TE缓冲液（pH 7.2），充分振荡混匀，-20℃冰冻1h，取出，迅速于65℃温浴30min，反复3次。……