先天性外中耳畸形(1)
——发育生物学研究进展

张天宇 李辰龙

先天性外中耳畸形(microtia and atresia，MA)也称小耳畸形，是颌面部最主要的出生缺陷之一，全球发病率约为2.06/10 000，其中我国的发病率为1.4/10 000。本病常涉及耳廓、外耳道、中耳，偶可累及内耳，可单独或联合发生；临床表现多样，包括：耳廓畸形，如：耳廓发育不良、残缺、皱缩、皮赘甚至无耳畸形，外耳道闭锁或狭窄，中耳畸形(如：听骨链畸形、面神经畸形)等；部分伴有颌骨发育畸形(半面短小)[1]。先天性外中耳畸形可以单独发生，也可以作为某一综合征的耳部症状出现，如：Treacher-Collins综合征、Nager综合征或眼-耳-脊柱发育不良等[2]。

Artunduaga等[3]分析了72对先天性外中耳畸形双胞胎，其中同卵双胞胎38对，10对均表现出耳廓畸形；虽然38对同卵双胞胎共享基因型，但仍有28对双胞胎并没有表现为耳廓畸形，且表现为耳廓畸形的10对双胞胎耳廓畸形程度不一。动物模型是研究先天性外中耳畸形发生机制的重要生物模式，各类基因敲除或突变动物模型大多表现为双侧耳廓畸形，且畸形程度相似[4～9]，这与患者流行病学调查结果并不相符，本病以单侧发病为主，且双侧发病患者耳廓畸形程度并非完全相同[10]。

胚胎时期第一、二鳃弓、第一鳃裂及第一咽囊发育异常可导致本病的发生[11]。发育生物学是理解先天性畸形的基础之一，了解外中耳结构的发育对理解先天性外中耳畸形的发生机制十分重要。

1 正常外中耳的发育

1.1耳廓的发育 外中耳是由内胚层第一咽囊、外胚层第一鳃弓(下颌弓)、第二鳃弓(舌骨弓)、第一鳃裂及中胚层间充质组织衍化而来。人类胚胎发育至第4周时出现鳃弓，为胚体头部两侧的柱状弓形隆起。颅神经嵴细胞(cranial neural crest cell，CNCC)是一种多能干细胞，是第一、二鳃弓区域间充质的主要细胞成分。CNCC的一个重要特征是其迁移性，不同部位CNCC各具特定的迁移路径，来源于中脑区后份及菱脑r1、r2节段的CNCC参与形成第一鳃弓，r3、r4节段的CNCC 参与形成第二鳃弓[12]。

经典的耳廓发育模式是His小丘模式，胚胎第5～6周，耳廓结构开始发育，第一、二鳃弓背侧端的间充质增生隆起，形成6个结节状小丘，其中3个出现在第一鳃弓尾部，3个出现在第二鳃弓头部。随着第一、二鳃弓及其之间的鳃裂发育，6个小丘逐渐融合，分化形成耳廓特定结构；第一鳃弓的3个小丘分别发育为耳屏、耳轮根部和耳轮脚；第二鳃弓的3个小丘发育成对耳轮、对耳屏、耳轮下部及耳垂。第12周，小丘完成融合，形成外耳(图1)。胚胎早期的耳廓发生于下颌骨尾部，接近颈根部，第20周时，随着第一鳃弓的不断发育，耳廓由颈后向正常耳区部位移行[13,14]。

第一鳃弓3个结节状小丘邻近的间充质及其表面覆盖的外胚层过度增生，可形成额外的耳结节而后发育形成副耳，副耳与正常耳廓的发育并无直接联系。随着第一、二鳃弓发育形成上颌骨、下颌骨及面部组织，位于第一、二鳃弓融合部位的副耳逐渐迁移，定位于耳前与口角之间的区域[15]。

1.2外耳道的发育 胚胎第6周，第一、二鳃弓之间的第一鳃裂向内延伸形成外耳道。胚胎第9周，作为第一鳃弓的衍生物，鼓环开始发育，鼓环在发育过程中逐渐变宽，其控制并调节第一鳃裂的内陷以形成耳道及鼓膜。第一鳃裂的中间部与鼓环紧密相连，其背侧末端的外胚层细胞增殖并向内生长，形成硬核被称为外耳道栓，协助外耳道向内扩大[16,17]。第21周时，外耳道栓通过复层鳞状上皮脱落逐渐形成外耳道的中空结构，这一过程是由角化引起的非凋亡性细胞程序性死亡[18]。至第28周时，外耳道最内侧的外胚层和第一咽囊外侧末端的内胚层相连形成鼓膜，第一鳃弓的部分中胚层间充质留在两层之间，分化为鼓膜的纤维层，鼓膜是耳部唯一包含3个胚层的结构。外耳道上皮分布着两种腺体，耵聍腺和皮脂腺，它们首先出现于胚胎第13周，在胚胎第6月时发育成熟；这些腺体可产生粘稠的分泌物、油脂并与角蛋白混合形成耵聍，参与维持外耳道的自净功能[19]。

图1 胚胎第5～6周耳廓发育及第一、二鳃弓各小丘发育成耳廓示意图 1～6分别为6个结节状小丘;a.耳廓发育示意图;b.各小丘发育成耳廓对应结构示意图

1.3中耳的发育 胚胎第3周出现第一咽囊，第6周时咽囊开始延长，第8周时形成早期中耳腔；早期中耳腔只有中耳的下一半，其余仍由结缔组织充填。随着第二鳃弓间充质将其收窄, 第一咽囊的近心部分延长变细形成咽鼓管，连接中耳腔和咽腔。

胚胎第6周，人耳听骨开始发育，第一、二鳃弓的间充质内形成3个听骨的软骨原基；Meckel软骨起源于第一鳃弓，第16周时形成鼓室支和下颌支，鼓室支最终分化为锤骨头、砧骨体和砧骨短脚，如发育时其原基未分离，则可形成锤砧融合畸形，先天性外中耳畸形患者中此类中耳畸形最为常见[20]。而下颌支与下颌骨的发育相关，因此，先天性外中耳畸形常合并下颌骨畸形，如：半面短小。Reichert软骨起源于第二鳃弓，分化为镫骨板上结构、锤骨柄和砧骨长脚；镫骨足板及环韧带是由耳囊和内耳原基发育而来。随着第一咽囊的不断扩展, 包绕3个逐渐成熟的听骨并形成中耳腔，所有外中耳结构在第30周发育完成[11]。

2 畸形外中耳的发育

先天性外中耳畸形是第一、二鳃弓综合征的特征性表现之一，第一、二鳃弓综合征是指源于胚胎期第一、二鳃弓、第一咽囊、第一鳃裂和颞骨原基的颅面结构发育不良而表现出的一组先天性畸形。第一、二鳃弓除发育成耳部外，还将发育成上颌骨、下颌骨、肌肉、颅神经，且心脏的脉管系统同样是由第一、二鳃弓包裹发育而成，因此，外中耳畸形常伴有下颌骨畸形和心脏畸形[21]。内耳由菱脑r5、r6节段的外胚层组织独立发育而成，因此，先天性外中耳畸形患者内耳大多正常。凡是能够影响第一、二鳃弓及CNCC迁移及分化的因素都可能导致先天性外中耳畸形的发生。

2.1耳廓、中耳畸形 先天性外中耳畸形的分级常采用Marx分类方法，Marx分类共有3级：Ⅰ°畸形，可见正常耳部解剖标志但较正常耳小；Ⅱ°畸形，患耳可见部分解剖标志；Ⅲ°畸形最为常见，耳廓为类似于花生样的未发育软组织[22]。在临床工作中，同一畸形程度的患者耳部表现仍具有一定差异。虽然本病的发生机制至今仍未明确，但多认为第一、二鳃弓的发育及CNCC迁移及分化过程中的影响因素与本病的发生密切相关。

目前已知的一个涉及耳廓发育的重要基因是同源盒转录因子Hoxa2，其在脊椎动物前后轴发育模式中起到重要作用。Hoxa2基因是第二鳃弓内唯一表达的Hox基因，Hoxa2缺失小鼠会使第二鳃弓转化成第一鳃弓的组织。若第一鳃弓CNCC中的Hoxa2基因表达异常，可诱导出现重复耳廓，原因是当某一体节Hox基因缺失，可导致其支配区域的组织分化成为其前一体节的相应结构。Minoux等研究发现，Hoxa2基因突变小鼠除了表现为无耳畸形，还出现了外耳道、鼓环、锤骨及砧骨的重复，而这些结构均来源于第一鳃弓[14,23,24]。敲除小鼠的Hoxa1和Hoxb1基因后，第二鳃弓CNCC 数量明显减少，表现为源于第二鳃弓的结构发育畸形及面神经发育异常[25]。

Treacher Collins综合征中Tcof1基因突变，造成Treacle蛋白单倍剂量不足，减少了核蛋白体和神经上皮细胞的生殖，使得移行到第一、二鳃弓的CNCC亦相应不足，最终导致了包括耳畸形在内的颅面畸形[26]。Tbx1基因突变可导致小耳畸形，但其并非直接作用于CNCC，而是通过引导来源于不同部位的CNCC以发挥作用，这种间接作用也会影响到CNCC的正常迁移与分化[27]。Wnt基因家族与CNCC的形成和发育相关，Wnt5a基因可在耳廓间充质中表达，且Wnt5a敲除小鼠表现为外耳发育不良[28]。内皮素通路在调节CNCC的增殖和迁移方面至关重要，内皮素及其受体突变的小鼠会表现出不同类型的耳畸形。转录因子Gsc作为内皮素通路的下游靶点，其在第一鳃裂周围的间充质中表达，与外耳、中耳的发育相关[25]。Msx2突变可引起偶数节段的菱脑原节CNCC凋亡增加，突变小鼠出现砧骨变形、镫骨未分化及上下颌骨发育不良等颅面部畸形[29]。

虽然各类基因敲除或突变动物模型大多表现为双侧耳廓畸形，且畸形程度相似，但Frem2基因缺陷小鼠表现为单侧耳廓畸形，且出生时常伴有患耳周围组织血肿，虽然该基因并不在血管中表达，但Frem2的相关蛋白涉及细胞外基质的调控，一旦缺乏此类蛋白，不仅会对形态造成影响，而且还会增加组织脆性；可能的作用机制是诱发了过多间充质细胞死亡，使得CNCC过分迁移及过早分化，进而引起外中耳畸形的发生[30]。

2.2外耳道畸形 外耳道是在耳廓基本形成之后才开始发育的，所以可以表现为单独的外耳道畸形而不伴有耳廓畸形。对于外耳道发育畸形的分类，国内外大多采用Schuknecht的分类方法，即根据外耳道畸形的程度大致分为4类，其中typeA和B为外耳道狭窄(有鼓膜)，type C和D为外耳道闭锁(无鼓膜)[31]。如外耳道最内侧的外胚层和第一咽囊外侧末端的内胚层未相连，则不会形成鼓膜，锤骨柄结构也将缺如；Ishimoto总结了50例先天性外耳道闭锁患者术中情况，发现所有耳道闭锁患者锤骨柄均缺如[32]，与我们的临床观察结果高度吻合。从发育生物学角度看，我们认为外耳道畸形可分为两类，即有鼓膜的外耳道狭窄和无鼓膜的外耳道闭锁更为合适[33]，这一分类有助于指导临床手术决策的选择。

外耳道在发育过程中是朝向鼓室定向生长的，该区域可能存在引导外耳道生长的信号。在Gsc和Prx突变的小鼠中，由于没有鼓环，外耳道并没有向鼓室的方向生长。Hoxa2基因突变小鼠出现了外耳道、鼓环的重复，且这两个外耳道分别向两个鼓环的方向生长[16,34]。先天性外耳道狭窄患者的外耳道与正常人相比，不仅存在口径上的区别，而且在形态、长度、位置、倾斜度及方向等方面均存在不同程度的差异，这种差异也使得先天性外耳道狭窄患者易形成外耳道胆脂瘤[35]。

外中耳的发育起源于内胚层第一咽囊, 外胚层第一、二鳃弓及其所包含的第一鳃裂, 以及其间的中胚层间充质。耳廓、鼓环和听骨均来自第一、二鳃弓，第一咽囊形成咽鼓管和中耳, 第一鳃裂构成原始外耳道。鼓膜是耳部唯一包含3个胚层的结构。近年来，随着二代测序等技术的推广，基因组数据库的不断完善，各个国家和地区的学者针对本病的家系及综合征开展了大量研究工作，超过18种小耳畸形相关综合征的致病基因已经逐渐明确。但本病以散发为主，非综合征型多见，其发病机制并未明确。深入了解外中耳的发育生物学基础，未来可以从表型-基因型入手，明确本病的遗传学病因和发病机制；还可以围绕胚胎-胎儿个体发育分化的重要阶段，研究发育的时程性调控机制，个体发育过程中的细胞迁移、凋亡等生命现象的机制。

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