土壤中单一及复合抗生素的降解及微生物响应

阮琳琳,林 辉,马军伟,孙万春,俞巧钢,符建荣



土壤中单一及复合抗生素的降解及微生物响应

阮琳琳1,2,林 辉2*,马军伟2,孙万春2,俞巧钢2,符建荣2*

(1.浙江师范大学生命与化学科学学院, 浙江 金华 321004；2.浙江省农业科学院环境资源与土壤肥料研究所, 浙江 杭州 310021)

基于LC-MS/MS、MicroRESPTM等技术,对比了磺胺二甲嘧啶(SM2)和强力霉素(DOX)在单一和共存条件下,在青紫泥和小粉土中的短期降解及土壤微生物代谢特征.结果表明,单一条件下,小粉土中SM2和DOX的3d和7d降解率总体高于青紫泥,SM2和DOX共存条件下可对土壤中二者的短期降解产生一定抑制,这种抑制作用在小粉土中更为明显.抗生素对土壤微生物代谢的影响与其赋存时间及土壤类型有关.在供试浓度10~20mg/kg 下,SM2和DOX在单一和复合条件下总体是促进土壤微生物代谢,但影响随赋存时间增加而减弱.青紫泥中,SM2和DOX共存下的土壤微生物代谢多样性高于二者单一存在,且青紫泥中DOX浓度与土壤代谢活性和微生物群落代谢多样性呈显著正相关,而小粉土中无类似的现象,但SM2与DOX复合污染对土壤微生物代谢的影响总体源于DOX的作用.

青紫泥；小粉土；磺胺二甲嘧啶；强力霉素；降解；土壤微生物；MicroRESPTM

我国一些农田土壤遭受抗生素污染已是一个不争的事实.在我国珠江三角洲地区、天津等地的蔬菜基地土壤中均检出了高浓度的抗生素,其中同时检出四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素的现象十分普遍[1-3].畜禽养殖废弃物农用是抗生素进入土壤的重要途径.通过对浙江省及其周边地区畜禽粪便源有机肥料中残留抗生素的研究发现,受检的300多个样品中,45.2%检出氟喹诺酮类抗生素,30.1%检出磺胺类抗生素,25.1%检出四环素类抗生素,其中部分样品强力霉素残留浓度在70mg/kg以上[4].大多数抗生素具有较高的生物活性,其必然存在一定的潜在生态环境风险.因此,关注畜禽粪便施用土壤中的抗生素污染问题必不可少.

抗生素进入土壤后会发生光解、水解、生物降解等一系列降解转化作用.土壤类型会影响抗生素的降解.部分研究指出[5],土壤有机质、氧化铁、阳离子交换总量、黏粒含量越高,抗生素在土壤中的降解速率越小,在土壤中就越稳定.同时,土壤微生物在抗生素的降解转化中也扮演重要角色.研究[6]发现,磺胺二甲嘧啶在未灭菌土中的半衰期仅是灭菌土中的一半.土壤湿度、pH值等也是影响抗生素在土壤中降解的重要因素[7],其通过改变土壤孔隙度、氧化还原电位、抗生素溶解性以及抗生素和土壤的吸附作用等对抗生素降解产生影响.总体上看,国内外针对抗生素在土壤中的迁移转化研究较多,但多针对单一抗生素.事实上,多种抗生素共存下的土壤微生态效应有异于单一抗生素污染[8-9],这两种不同条件下抗生素的迁移转化行为也很可能完全不同.因此,单一和复合条件下各类抗生素在土壤中的迁移转化行为和土壤微生物效应差异值得探讨,其对于评估实际生产中有机肥料残留抗生素的生态风险具有很强的指导意义.

基于以上现状及问题,本文以在浙江省有机肥料中检出频率和检出浓度均较高的磺胺二甲嘧啶和强力霉素[4]为研究对象,结合LC-MS/ MS、MicroRESPTM等技术,利用室内土壤培养试验,分析伴随有机肥料施用进入两种不同类型土壤中的抗生素的迁移转化行为和土壤微生物代谢响应,以期为评价有机肥料中残留抗生素的土壤生态风险和环境归趋提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试有机肥料取自浙江常山堆肥厂,以猪粪为主要原料,经过堆肥发酵、后熟和烘干等流程,其基本理化性质为:含水率13.52%,pH =8.48,电导率(EC)5800μs/cm,总氮3.88%,有机质61.80%,全磷4.86%,全钾2.42%.抗生素残留检测结果指出,有机肥料中含磺胺二甲嘧啶(SM2) 1.40μg/kg、强力霉素(DOX)351.10μg/kg、金霉素109.38μg/kg、磺胺氯哒嗪 5.44μg/kg, 磺胺-6-甲氧嘧啶3.49μg/kg,残留浓度均以干基计.供试土壤有两种,分别为水稻土(青紫泥)和潮土(小粉土),土壤采集后,经风干和去除石子、植物根等杂质,并过10目筛后备用.小粉土取自慈溪掌起镇,为旱作土壤,常年种植蔬菜,pH(土:水=1:2.5)7.3,田间最大饱和持水率50%,有机质0.36%,全氮0.15%,有效磷78.88mg/kg,速效钾102mg/kg.水稻土(青紫泥)取自绍兴孙端镇,为水稻土,常年种植蔬菜,pH(土:水=1:2.5)6.0,田间最大饱和持水率55%,有机质0.76%,全氮0.13%,有效磷17.32mg/kg,速效钾167mg/kg.两种供试土壤中均无强力霉素和磺胺二甲嘧啶检出.供试抗生素为磺胺二甲嘧啶(SM2)、强力霉素(DOX),购买自sigma公司,纯度>99%.这两种抗生素均为本课题组在2013年浙江省有机肥抗生素残留调查中检出频率最高的磺胺类和四环素类抗生素[4].

1.2 室内土壤培养试验

取100mL的灭菌圆形窄口玻璃瓶,装风干土30g,随后添加1.5%不同抗生素处理的有机肥料,上下反复颠倒混匀,形成不同的抗生素处理土壤;用无菌水调节土壤水分含量至田间最大饱和持水率的50%,接着用透气不透水的Parafilm膜封口,置于温度25°C,湿度50% 的恒温恒湿培养箱中避光培养,定期称重并补充无菌水以保持土壤湿度.本试验涉及的两种土壤类型,每种土壤类型有6个抗生素处理,分别为:(CK)不添加外源抗生素;(SM2-10)添加磺胺二甲嘧啶,10mg/kg; (DOX-10)添加强力霉素,10mg/kg;(SM2-DOX), 10mg/kg磺胺二甲嘧啶+10mg/kg强力霉素; (SM2-20)磺胺二甲嘧啶,20mg/kg;(DOX-20)强力霉素,20mg/kg.每个处理重复3次.在培养的第3d和第7d进行破坏性采样,土壤样品采集后分成两份,一份采集后立即用于MicroRESPTM实验,另一份-20℃保存用于抗生素检测.将抗生素添加到有机肥的方法如下:精确称取目标抗生素0.1g,溶解于100mL甲醇溶液中,配制成1mg/mL的抗生素甲醇母液,按每组抗生素的添加水平,加一定量抗生素甲醇溶液到0.45g有机肥中,在通风橱中过夜挥发,去除甲醇,形成抗生素残留有机肥料.其中空白对照有机肥料为无抗生素的甲醇溶液,制备方法同抗生素处理有机肥.

1.3 土壤中抗生素提取和测定

取-20℃保存的土壤样品,采用固相萃取-液相色谱串联质谱法进行抗生素定量检测,具体方法参照Wang等[10]的报道.大致步骤如下:称取1.00g样品(精确至0.01g)至50mL聚丙烯离心管中,加入内标溶液,放置10min;加入25mL提取剂,涡旋30s,超声30min,5000r/min离心10min,将上清液转移至圆底烧瓶中;残渣用25mL提取液再提取一次;将两次上清液于圆底烧瓶中混合;将圆底烧瓶放于旋转蒸发仪上干燥,水浴温度为40℃;用5mL的磷酸盐缓冲液充分超声重悬,此步骤重复3次;将所有重悬液过6cc/200mg OasisÒHLB固相萃取小柱(Waters);收集洗脱液于玻璃刻度管中,45℃氮气吹干,用体积比为1:1的甲醇-水溶液定容至1mL,过0.22μm有机滤膜,液相色谱-串联质谱(LC-MS/ MS)测定,内标法定量.其中土壤中的强力霉素提取采用EDTA溶液(pH 12),磺胺二甲嘧啶的提取采用磷酸盐缓冲液(pH 4.0).

色谱条件:DOX的色谱柱为Endeaorsill C18柱(1.8μm, 2.1mm×50mm),SM2色谱柱为Phenomenex C18柱(3μm, 2.0mm´150mm); Thermo Finnigan Surveyor HPLC系统(Thermo Scientific, USA);流速:0.25mL/min;柱温:30℃;进样量:5μL.流动相A:甲醇,B:甲酸-水(1:1000,体积比),等度洗脱:0min(40%A)→5.0min(40%A).质谱分析采用TSQ Quantum Discovery三级四极杆质谱仪(美国,Thermo Fisher Scientific公司)配ESI离子源.磺胺二甲嘧啶和强力霉素的回收率和检测范围如表1所示.

表1 DOX和SM2的回收率和检测灵敏度

注:*2μg/g、20μg/kg和200μg/kg 3个不同标准物浓度添加下的回收实验结果.±表示标准差.

1.4 MicroRESPTM分析

MicroRESPTM技术是一种较为灵敏、快捷的用于研究原位土壤微生物群落水平生理特征(CLPP)的方法[11],其不破坏土壤中微生物生活环境,测定的微生物信息较为全面.MicroRespTM操作方法参见Campbell等的研究报告[12].大致流程:将待测土壤样品均匀添加到深孔板中,随后加入水和15种碳源底物,将配制好的检测板倒扣在深孔板上,25℃培养6h后,利用酶标仪读取570nm波长下检测板的吸光值;测定检测板在样品培养前和培养6h后的吸光值,通过吸光值差异计算CO2产生率.15种碳源底物依次为丙氨酸、L-阿拉伯糖、L-精氨酸、L-盐酸半胱氨酸、柠檬酸、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、α-氨基丁酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-苹果酸、N-乙酰葡萄糖胺、草酸、原儿茶酸、D-海藻糖.检测板制备方法如下:将甲酚红(12.5mg/L)、氯化钾(150mmol/L)和碳酸氢钠(2.5mmol/L)混合制成指示剂;同时配制3%的纯化琼脂,加入2倍胶体积的指示剂;然后将指示琼脂添加到检测板的微孔中,每孔150µL,最后配制好的检测微孔板存放于含碱石灰(70%CaO, 20%水,3%NaOH,1%KOH)的干燥器中待用.

1.5 数据处理

不同处理中土壤抗生素降解率计算方法如下:

式中:C0为培养前土壤中抗生素的初始浓度,C为采集土壤样品中抗生素的残留浓度.

利用Shannon-Winner香农多样性指数(H)分析不同处理对土壤微生物群落代谢多样性的影响.利用香农多样性指数(H)可以了解土壤微生物群落利用碳源类型的多与少,即功能多样性,一般来说土壤微生物群落中物种越多,香农多样性指数越高,群落多样性越好.计算公式:

式中:表示16种底物的土壤CO2呼吸速率,P为每个底物呼吸速率占所有底物呼吸速率的比值.

采用SPSS 15.0对MicroRESPTM底物诱导呼吸数据进行聚类分析,同时采用SPSS开展单因素方差分析(One-way ANOVA,最小显著差法LSD)和多因素方差分析.利用SigmaPlot 10.0作图及CANOCO 4.5开展典范对应分析(CCA).

2 结果与分析

2.1 磺胺二甲嘧啶和强力霉素单一及复合条件下在不同类型土壤中的降解转化

图1 不同处理下SM2和DOX在青紫泥和小粉土中的降解率

由图1(a)、图1(b)可知,青紫泥中,单一及复合抗生素处理SM2和DOX 3d和7d降解率均无显著(<0.05)差异,因此SM2与DOX共存并没有对青紫泥中SM2和DOX的短期降解产生显著影响.此外,单一污染下,青紫泥中SM2增加会显著(<0.05)抑制其降解,但DOX浓度变化对其的短期降解无显著(>0.05)影响.与青紫泥有所不同,SM2与DOX共存强烈抑制了小粉土中SM2和DOX的降解[图1(c),图1(d)].小粉土中SM2 3d降解率在单一及复合抗生素处理之间无显著差异,但SM2-DOX处理的平均降解率总体低于SM2-10处理,特别是复合抗生素处理的SM2 7d降解率显著低于所有单一SM2处理(SM2-10、SM2-20);而SM2-DOX处理小粉土中DOX 3d和7d降解率均显著低于所有单一DOX处理.总体上看,小粉土中SM2和DOX的早期降解更易被复合抗生素污染所抑制.在供试浓度下,单一污染下小粉土中SM2和DOX的早期降解均不受其浓度增加的显著影响.对比图1(a)、(b)和图1(c)、(d)发现,单一污染下SM2和DOX在小粉土中的降解率总体高于青紫泥.表2对比了20mg/kg抗生素添加下,不同类型土壤中总抗生素的残留情况,可知单一污染下,小粉土中总抗生素残留基本低于青紫泥,这一结果进一步证实抗生素在小粉土的降解高于青紫泥.抗生素在土壤中的降解与其化学结构、土壤pH值、温度、水分、土壤微生物组成和活性有关[13].

表2不同处理下青紫泥和小粉土中抗生素总残留浓度

Table 2 Total residual concentrations of antibiotics within the purple clay and silt soil in different antibiotic treatments

注:对相同采样时间的不同抗生素处理进行单因素方差分析,同一列上标记不同字母表示各抗生素处理间差异显著(<0.05,=3);*抗生素残留=磺胺二甲嘧啶残留+强力霉素残留.

2.2 磺胺二甲嘧啶和强力霉素单一及复合处理对不同类型土壤微生物群落代谢结构的影响

图2 不同处理下3d和7d采集土壤中微生物群落代谢结构差异聚类分析

x:小粉土;q:青紫泥;1_3d、1_7d:CK;2_3d、2_7d:SM2-10;3_3d、3_7d:DOX-10;4_3d、4_7d:SM2+DOX;5_3d、5_7d:SM2-20;6_3d、6_7d:DOX-20

为了探讨不同处理土壤微生物群落代谢结构变化,对不同碳源底物诱导呼吸(SIR)数据进行聚类分析(图2).由图2a可知,3d的土壤样品中,青紫泥DOX-10和青紫泥DOX-20聚为一类,青紫泥SM2-DOX聚为一类,其余处理聚为一类,表明抗生素进入土壤3d后对青紫泥微生物群落结构产生明显影响,DOX产生的影响大于SM2.有相关研究发现,含磺胺嘧啶的有机肥施入两种不同的耕作土壤后,1d内土壤CO2释放量有所减少[14].试验结果与此类似,3d后青紫泥中DOX的影响比SM2大.且复合处理青紫泥微生物群落代谢结构不同于单一处理,而相同条件下,抗生素对小粉土微生物群落代谢结构的影响较小.在7d的土壤样品中,青紫泥和小粉土的微生物群落代谢结构各单独聚为一类(图2b).由上,可推测抗生素残留有机肥料进入土壤3d内对土壤微生物群落的影响大于土壤类型对微生物群落的影响,而7d后抗生素的影响与土壤类型的相关性不明显,但相关结论需要进一步验证.

2.3 SM2和DOX单一及复合处理对不同类型土壤微生物群落代谢多样性的影响

抗生素对土壤微生物群落代谢多样性的影响与土壤类型有关(表3).青紫泥中,SM2-DOX处理微生物群落代谢多样性与DOX-10无显著差异,但显著高于CK和SM2-10,暗示SM2-DOX处理对青紫泥代谢多样性的促进主要与DOX有关.青紫泥土壤微生物群落代谢多样性的多因素方差分析结果也表明,仅有DOX对土壤微生物群落代谢多样性呈显著(<0.01)影响,而SM2以及二者的交互作用均无显著(>0.05)影响.抗生素对小粉土微生物群落代谢的影响与其在土壤中的暴露时间有关,但无论是3d还是7d的土壤多样性数据均表明SM2-DOX处理对土壤代谢多样性的影响类似于DOX-10.从3d和7d的小粉土微生物群落代谢多样性的多因素分析结果可知,仅有DOX的影响是显著(<0.01)的,而2种抗生素的交互作用只对3d的土壤样品有显著(<0.01)影响,SM2的影响均是不显著(>0.05)的.因此可初步推测,SM2与DOX共存对土壤微生物代谢多样性的影响主要归功于DOX的作用.

表3 皮尔逊相关分析研究抗生素残留浓度与土壤微生物代谢的关系

注 :对相同采样时间的不同抗生素处理进行单因素方差分析,同一列上标记不同字母表示不同处理间差异显著(<0.05,=3).

2.4 抗生素浓度与土壤微生物群落代谢的关联分析

采用典范对应分析(CCA)研究抗生素总残留浓度、磺胺二甲嘧啶浓度和强力霉素浓度与土壤微生物群落代谢结构的相关性,通过蒙特卡罗检验对3个因子的影响程度进行显著性分析.结果表明,抗生素进入土壤3d后,各因子对土壤微生物群落代谢的影响程度大小为抗生素总残留浓度(=3.02,=0.03)>强力霉素浓度(=1.57,=0.19)>磺胺二甲嘧啶浓度(=0.16,=0.19).抗生素进入土壤7d后,各因子对土壤微生物群落代谢的影响程度大小为抗生素总残留浓度(=0.36,=0.74)>强力霉素浓度(=0.29,=0.75)>磺胺二甲嘧啶浓度(=0.11,=0.97).因此,抗生素总残留浓度和强力霉素浓度对土壤微生物群落代谢结构的影响大于磺胺二甲嘧啶浓度,且抗生素进入土壤3d对土壤微生物群落代谢结构的影响大于其进入土壤7d的影响,这与抗生素前期快速降解,后期缓慢降解有关[15],这一结论与图2和表3中所得的推测相一致.

表4 不同抗生素处理下青紫泥和小粉土中的微生物群落代谢多样性

注:*不同处理间差异显著(<0.05,=3)**不同处理间差异极显著(<0.01,=3).

表4进一步对抗生素总残留浓度与土壤代谢活性(基础呼吸)和土壤微生物群落代谢多样性(香农指数)开展皮尔逊相关分析,结果表明青紫泥中土壤基础呼吸和香农指数与抗生素残留总浓度和强力霉素浓度呈显著正相关,而与磺胺二甲嘧啶浓度无明显相关性,而小粉土中土壤代谢活性和多样性与抗生素残留浓度无类似的相关关系.因此,青紫泥中强力霉素浓度的上升增加了土壤代谢活性和微生物群落代谢多样性,而小粉土中强力霉素对微生物代谢无类似促进作用.表4结果从一定程度上反映抗生素降解率的升高可以诱导土壤微生物群落代谢活性和多样性的下降,缓解抗生素对土壤微生物代谢的刺激效应.同时,土壤总抗生素降解率与基础呼吸(Pearson相关系数=-0.73,<0.05)和香农指数(Pearson相关系数=-0.63,<0.05)均呈显著负相关关系.

3 讨论

3.1 土壤中抗生素降解转化行为

抗生素在土壤中的降解行为受到众多因素的影响.例如,不同土壤的有机质、氧化铁含量、阳离子交换总量、黏粒含量、最大饱和持水率等均会影响抗生素降解转化.有研究表明[16],砂质土壤中抗生素的早期降解明显快于黏壤土,但到了后期,两者的最终下降量逐渐接近.王娜的研究指出[17],抗生素在土壤中的吸附性也会影响抗生素在土壤中的降解转化,其中吸附性强的土壤中磺胺类抗生素不容易转化,而吸附性与土壤pH值及有机质含量有一定的关系.一般认为,土壤有机质、氧化铁含量、阳离子交换总量、黏粒含量越高,抗生素在土壤中的降解速率越小,在土壤中就越稳定[5].在本研究中,无论是磺胺二甲嘧啶还是强力霉素,其在小粉土中的早期降解均高于其在青紫泥中,这可能与小粉土的有机质含量、黏粒含量以及阳离子交换总量均低于青紫泥有关[18].

此外,本文重点考察了磺胺二甲嘧啶和强力霉素复合污染下二者短期降解行为与单一污染下的差异,结果发现强力霉素和磺胺二甲嘧啶共存轻微抑制了土壤中磺胺二甲嘧啶和强力霉素的降解,表现出协同抑制作用,且复合污染对抗生素短期降解的这种协同抑制在小粉土中非常明显.显然,相比青紫泥,小粉土中强力霉素和磺胺二甲嘧啶的早期降解更容易被复合污染所抑制,这可能与不同土壤的微生物群落结构尤其是抗生素降解微生物对复合污染的响应差异有关.复合与单一抗生素污染条件下不同的抗生素降解行为在少数报道中亦有提及,但是结论不尽相同.例如,Ma等[19]研究发现磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、环丙沙星(CIP)和四环素(TC)复合污染显著促进了SMM、CIP和TC在土壤中的降解;Fang等[20]研究发现磺胺嘧啶(SDZ)和金霉素(CTC)共存对二者在土壤中的降解行为无显著影响.因此,复合和单一抗生素污染对土壤抗生素降解行为的影响差异与其所在的环境条件密切相关.本文证实,在相同条件下,复合和单一抗生素污染对土壤抗生素降解行为的影响在小粉土和青紫泥中就存在差异,因此土壤类型是影响因素之一.其次,开展试验的条件不同也可能影响结论.Ma等[19]在实地青菜盆栽条件下开展研究工作,在这一过程中,抗生素的转化行为包括光解、水解和生物降解,其中光解的作用不容小觑,此外蔬菜栽培也会影响抗生素的降解行为[10].同时,本试验中抗生素是伴随有机肥料进入土壤的,有机肥料对土壤理化和微生物的影响也会从一定程度上影响抗生素的降解.本文和Fang等[20]则均采用室内土壤暗培养试验,光解的贡献很小,且也不受蔬菜生长和自然温湿度变化的影响,因此本文中青紫泥的结果与Fang等[20]的结果非常类似.当然,不同抗生素添加浓度可能是造成差异的原因,本文和Fang等[20]研究所添加的抗生素浓度仅是Ma等[19]报道的十分之一.

3.2 抗生素对土壤微生物的影响

土壤微生物是土壤的重要组成部分,是评价土壤质量的生物学指标之一.土壤微生物的代谢行为可以从一定程度上反映土壤活力和质量,也与土壤生态系统平衡维系密切相关[21].抗生素是以微生物为作用靶标的,而土壤的功能(包括有机质降解、养分和能量的转化)都是以微生物活动为基础的.事实上,相对于土壤动物和植物,土壤微生物对抗生素等外源污染的胁迫更加敏感[22].因此,了解抗生素的土壤微生物生态学效应对于抗生素的生态环境风险评估以及预测抗生素在土壤中的分解命运均至关重要.

抗生素作为一种外源物质进入土壤,其即可抑制也可促进土壤微生物代谢活动[20,23-24]受到土壤中抗生素赋存浓度的影响.在一定浓度范围内,抗生素可以刺激土壤微生物,诱导呼吸作用增强,这种现象非常普遍[20,23].本文亦发现了类似的结果,在供试浓度10~20mg/kg下,SM2和DOX的单一和复合污染总体是增加了土壤微生物代谢活力,提高微生物群落代谢多样性,从一定程度上反映土壤微生物种群的增加和代谢底物谱的扩大.事实上,四环素类抗生素中的强力霉素常被发现可以促进土壤微生物代谢,低浓度的强力霉素甚至可以提高植物发芽率和生物量[10].有研究者认为,强力霉素的低生物毒性使其成为土壤微生物的潜在利用底物[25],从而扩大了土壤中可利用的底物谱,进而从一定程度上提高土壤微生物代谢活性和多样性.不过,我们认为,这一现象更可能是土壤微生物生态系统应对外界刺激的一种反应,是土壤启动自我修复的一种反馈机制.此外,抗生素对土壤微生物的影响是一种动态的模式,随其在土壤中的暴露时间的增加而改变.Lin等[8]报道发现,抗生素对土壤微生物的影响会随暴露时间的增加而减弱,而本研究的结果也暗示抗生素残留有机肥料进入土壤3d对土壤微生物群落的影响大于土壤类型,而7d后抗生素的影响小于土壤类型,与前期报道结论有类似之处.事实上,抗生素在土壤中的降解会导致抗生素土壤微生物胁迫效应的逐步减弱,本研究在抗生素浓度与土壤微生物群落代谢的关联分析中同样证实了这一情况.

另外,随抗生素在土壤赋存时间的增加,土壤微生物对这种外源刺激的适应以及自我调节也会改变土壤微生物对抗生素胁迫的应答.

复合和单一抗生素污染下土壤微生态效应差异仍是本研究探讨的重点.在本文中,SM2和DOX共存对土壤微生物群落代谢的影响没有表现出明显的协同或相加效应.DOX对土壤微生物群落代谢的影响远高于SM2的影响.DOX是复合污染土壤微生物群落代谢结构和多样性改变的主要污染因子.在青紫泥中,DOX浓度甚至与土壤代谢活性和微生物群落代谢多样性呈显著正相关.我们注意到,四环素类抗生素对土壤微生物的这种强烈干扰在以往报道中亦有提及.Lin[8]等通过高通量测序研究了四环素、环丙沙星和磺胺间甲氧嘧啶单一及复合条件下的土壤细菌群落结构响应,指出三种抗生素复合处理土壤的细菌群落结构与四环素单一处理土壤的相似度远高于环丙沙星和磺胺间甲氧嘧啶单一处理土壤.此外,复合和单一抗生素污染土壤的微生物群落代谢差异随土壤类型的变化也发生了改变.青紫泥和小粉土具有完全不同的理化性质,因此可知二者的微生物群落结构和代谢功能存在较大差异,这点可以从土壤微生物群落代谢结构差异的聚类分析结果(图2)中得到证实.不同土壤微生物群落的差异可能是二者应答抗生素污染产生不同响应的原因,但仍需进一步的深入研究.

4 结语

SM2和DOX共存会对二者在土壤中的短期降解及土壤微生物效应产生一定影响,且与土壤类型相关.在小粉土中二者复合污染对SM2和DOX的短期降解表现出强烈的协同抑制效应,这种抑制效应在青紫泥不显著.但SM2和DOX的单一和复合污染总体表现为促进土壤微生物代谢活力,提高微生物群落代谢多样性.其中DOX对土壤微生物群落代谢的影响远高于SM2的影响,是复合污染土壤微生物群落代谢结构和多样性改变的主要因子.

在单一污染条件下,小粉土中SM2和DOX的早期降解均高于青紫泥.DOX浓度与青紫泥微生物代谢活性和多样性呈显著正相关,表现为土壤微生物代谢随DOX浓度的增加而增加,但小粉土无类似现象.

综上,建议未来在评价环境抗生素的归趋和生态风险时多考虑区域土壤特点及多种抗生素之间的相互作用,从而有助于更加全面、系统和准确判断有机肥料中抗生素污染可能带来的潜在风险和环境问题.

[1] 成玉婷,吴小莲,向 垒,等.广州市典型有机蔬菜基地土壤中磺胺类抗生素污染特征及风险评价 [J]. 中国环境科学, 2017, 37(3):1154-1161.

[2] 邰义萍,莫测辉,李彦文,等.东莞市蔬菜基地土壤中四环素类抗生素的含量与分布 [J]. 中国环境科学, 2011,31(1):90-95.

[3] 邰义萍,莫测辉,李彦文,等.长期施用粪肥土壤中喹诺酮类抗生素的含量与分布特征 [J]. 中国环境科学, 2010,30(6):816-821.

[4] Qian M, Wu H, Wang J, et al. Occurrence of trace elements and antibiotics in manure-based fertilizers from the Zhejiang Province of China [J]. Science of the Total Environment., 2016, 559:174-181.

[5] 王丽平.典型外源抗生素在土壤中的转归及其与土壤微生物多样性的相互作用和机理研究 [D]. 杭州:浙江大学, 2008.

[6] 王 冉,刘铁铮,耿志明,等.兽药磺胺二甲嘧啶在土壤中的生态行为 [J]. 土壤学报, 2007,44(2):307-311.

[7] Yang J F, Ying G G, Yang L H, et al. Degradation behavior of sulfadiazine in soils under different conditions [J]. Journal of Environmental Science and Health. part.b Pesticides Food Contaminants and Agricultural Wastes, 2009,44(3):241.

[8] Lin H, Jin D, Freitag T E, et al. A compositional shift in the soil microbiome induced by tetracycline, sulfamonomethoxine and ciprofloxacin entering a plant-soil system [J]. Environmental Pollution, 2016,212:440-448.

[9] Ma J W, Lin H, Sun W C, et al. Soil microbial systems respond differentially to tetracycline, sulfamonomethoxine, and ciprofloxacin entering soil under pot experimental conditions alone and in combination [J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2014,21(12):7436-7448.

[10] Wang J, Lin H, Sun W, et al. Variations in the fate and biological effects of sulfamethoxazole, norfloxacin and doxycycline in different vegetable-soil systems following manure application [J]. Journal of Hazardous Materials, 2015,304:49-57.

[11] 陈晓娟,吴小红,刘守龙,等.不同耕地利用方式下土壤微生物活性及群落结构特性分析:基于PLFA和MicroRESPTM方法 [J]. 环境科学, 2013,34(6):2375-2382.

[12] Campbell C D, Chapman S J, Cameron C M,et al. A rapid microtiter plate method to measure carbon dioxide evolved from carbon substrate amendments so as to determine the physiological profiles of soil microbial communities by using whole soil [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(6):3593- 3599.

[13] 徐秋桐,顾国平,章明奎.有机肥对土壤中抗生素降解的促进作用[J]. 浙江农业学报, 2015,27(3):417-422.

[14] Kotzerke A, Sharma S, Schauss K, et al. Alterations in soil microbial activity and N-transformation processes due to sulfadiazine loads in pig-manure [J]. Environmental Pollution, 2008,153(2):315.

[15] 唐非凡.金霉素、磺胺嘧啶在土壤中的降解特征及其对土壤微生物的影响[D]. 杭州:浙江大学, 2012.

[16] 普锦成,章明奎.泰乐菌素和土霉素在农业土壤中的消解和运移 [J]. 中国生态农业学报, 2009,17(5):954-959.

[17] 王 娜.环境中磺胺类抗生素及其抗性基因的污染特征及风险研究 [D]. 南京:南京大学, 2014.

[18] 俞巧钢,符建荣.含DMPP抑制剂尿素的氨挥发特性及阻控对策研究 [J]. 农业环境科学学报, 2009,28(4):744-748.

[19] Ma J W, Lin H, Sun W C, et al. Soil microbial systems respond differentially to tetracycline, sulfamonomethoxine, and ciprofloxacin entering soil under pot experimental conditions alone and in combination [J].Environmental Science & Pollution Research, 2014,21(12):7436-7448.

[20] Fang H, Han Y, Yin Y,et al. Variations in dissipation rate, microbial function and antibiotic resistance due to repeated introductions of manure containing sulfadiazine and chlortetracycline to soil [J]. Chemosphere, 2014,96C:51-56.

[21] 孙 波,赵其国,张桃林,等.土壤质量与持续环境──Ⅲ.土壤质量评价的生物学指标 [J]. 土壤通报, 1997,29(5):225-234.

[22] Giller K E, Witter E, Mcgrath S P. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils: a review [J]. Soil Biology and Biochemistry, 1998,30(10/11):1389- 1414.

[23] Vaclavik E, Halling-Sørensen B, Ingerslev F. Evaluation of manometric respiration tests to assess the effects of veterinary antibiotics in soil [J]. Chemosphere, 2004,56(7):667-676.

[24] Liu B, Li Y, Zhang X, et al. Effects of chlortetracycline on soil microbial communities: Comparisons of enzyme activities to the functional diversity via Biolog EcoPlates™ [J]. European Journal of Soil Biology, 2015,68:69-76.

[25] Fang H, Han Y, Yin Y M, et al. Variations in dissipation rate, microbial function and antibiotic resistance due to repeated introductions of manure containing sulfadiazine and chlortetracycline to soil [J]. Chemosphere, 2014,96:51-56.

Behavior and ecotoxicity of single and mixed antibiotics in soils: Degradation and changes in microbial community.

RUAN Lin-lin1,2, LIN Hui2*, MA Jun-wei2, SUN Wan-chun2, YU Qiao-gang2, FU Jian-rong2*

(1.College of Life and Chemical Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China；2.Institute of Environmental Resources and Soil Fertilizers, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)., 2018,38(3)：1081~1089

This work studied the short-term degradation of antibiotics in a purple clay and a silt soil after individual and combined application of sulfadimidine (SM2) and doxycycline (DOX); the responses of soil microbial community metabolism to different antibiotics perturbation were also compared; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and MicroRESPTMtechnology were used herein. Results indicated that the degradation rates of both SM2 and DOX on the 3rdand 7thday in the silt soil were higher than that in the purple clay. Compared with that in single antibiotic pollution systems, co-existence of DOX and SM2 in combined antibiotics pollution system inhibited the short-term degradation of both antibiotic types in the two soil types; this inhibition was stronger in the silt soil. Both the single and mixed antibiotics in this work enhanced the metabolisms of soil microbial community with antibiotic exposure concentration from 10mg/kg to 20mg/kg, whereas the impacts of antibiotics decreased as the exposure time of the antibiotic increased. In the purple clay, the mixed antibiotic treatment showed significantly higher metabolic diversity of soil microbial community than all the single antibiotic treatments; its metabolic activity and diversity of soil microbial community correlated positively and significantly with the DOX concentration. However, similar phenomena were not seen in the silt soil. Meanwhile, the effect of mixed antibiotic on soil microbial community metabolism was mainly due to the function of DOX herein.

purple clay；silt soil；sulfadimidine；doxycycline；degradation；soil microorganism；MicroRESPTM

X53

A

1000-6923(2018)03-1081-09

阮琳琳(1993-),女,浙江宁波人,硕士研究生,主要从事农业环境微生物及有机肥安全使用研究.

2017-08-30

国家自然科学基金资助项目(31672234,41401542, 31670110);浙江省科公益技术应用项目(2017C32005, LGN18D010005)

* 责任作者, 符建荣, 研究员, fujr@mail.zaas.ac.cn; 林 辉, 副研究员, lin82774872@163.com