B类1型清道夫受体基因敲除雌鼠不孕相关机制的研究进展

张刘洋，龚婷，喻红，张元珍*

(1.武汉大学中南医院生殖医学中心，武汉 430071；2.海南省第三人民医院妇产科，三亚 572099；3.武汉大学基础医学院生物化学与分子生物学系，武汉 430071)

WHO一项调查结果显示，截止2010年底，发展中国家平均每4个家庭中就有1对夫妇受到女性不孕的困扰[1]。女性不孕的主要病因包括卵巢功能障碍、输卵管异常、子宫异常及不明原因的不孕等。其中，不明原因的不孕约占10～20%[2]，目前应用的检测手段无法对其进行确诊，且缺乏肯定有效的治疗方法和疗效指标，不明原因的不孕是女性不孕中仍待攻克的一大难题。另一方面，随着生活水平的提高，不健康的生活方式所导致的肥胖、高脂血症等疾病已成为人群中的常见病，脂代谢异常与不孕之间的关系也逐渐被人们所发现和重视。

B类1型清道夫受体(scavenger receptor class B type I，SR-B1)是首个被明确的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)受体[3]，SR-B1基因敲除(SR-B1 gene knockout，SR-B1-/-)小鼠除HDL及胆固醇代谢紊乱、动脉粥样硬化易感等特点外，还表现为雌性不孕。与此同时，大量流行病学研究显示，人类SR-B1基因(SCARB1)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与血脂水平、冠心病易感性等有显著相关性[4-5]，且SCARB1 rs4238001 SNP(G2S 突变)与卵泡液中孕酮水平下降及胚胎移植存活率显著降低有关，rs10846744 SNP也显示与胚胎存活率较低有关[6]。

多项研究证实，SR-B1-/-雌鼠体内异常的脂蛋白代谢与其不孕有密切的关联，但其具体机制尚未明确。本文将从SR-B1的功能特点及SR-B1-/-雌鼠的病理改变出发，对其不孕的可能相关机制进行探究和分析。

一、SR-B1的基本功能

1.SR-B1参与细胞对脂蛋白胆固醇的摄取：SR-B1能以高亲和力结合HDL而选择性介导胆固醇摄取，它主要分布在肝脏、类固醇激素生成器官等组织细胞膜表面，参与胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)及类固醇合成细胞的胆固醇摄取等过程。

RCT的最终环节中，肝细胞表面的SR-B1可与携有肝外组织胆固醇的HDL颗粒结合，HDL中胆固醇酯(cholesteryl ester，CE)被肝细胞选择性摄取进入胞内，随之被代谢为胆汁而排出体外[7]。此外，肝细胞表面的SR-B1还可介导细胞对HDL中脂质氢过氧化物的选择性摄取[8]，以避免累积的脂质氧化产物对HDL结构和功能产生损害。

在性腺、肾上腺等组织中，也可发现SR-B1的大量表达。性腺组织合成的性激素是一类甾体激素，卵巢所分泌的两种性激素——雌激素与孕激素，分别由卵泡内的颗粒细胞和排卵后形成的黄体细胞合成并分泌。研究发现，小鼠卵巢黄体细胞的SR-B1基因沉默后其胞内胆固醇浓度显著降低[9]，而大鼠卵巢颗粒细胞的CE摄取过程也被证实与SR-B1密切相关[10]。也就是说，SR-B1在卵巢性激素的合成过程中发挥了一定的作用。

2.SR-B1介导胞内游离胆固醇的外流：在符合胆固醇浓度梯度的条件下，细胞表面的SR-B1还可介导胞内游离胆固醇(free cholesterol，FC)流向胞外成熟的HDL颗粒[11]。

巨噬细胞表面主要存在三种分子可介导胞内FC的外流：SR-B1，三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)，和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)。SR-B1和ABCG1主要介导胞内FC外流至HDL颗粒，ABCA1则负责将磷脂和FC转运至胞外缺乏脂质的载脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)或载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)上。在人巨噬细胞中，ABCA1和SR-B1是胆固醇外流的主要途径[12]。显然，在ABCA1途径缺陷的情况下，作为抗动脉粥样硬化的协助环节之一，SR-B1介导巨噬细胞内FC外流的重要性就显得尤为突出。接受ABCA1/SR-B1双敲除小鼠骨髓的LDLR基因敲除(LDLR-/-)小鼠，其体内动脉粥样硬化的发展程度远远高于接受ABCA1基因敲除小鼠骨髓的LDLR-/-小鼠水平[13]，这一现象也就可以得到合理的解释。

3.SR-B1的抗炎、抗氧化作用：多项研究结果表明，SR-B1与机体内促炎细胞因子水平密切相关[14]。在受到炎性因子的刺激时，核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)可被激活，从而进一步提高炎性因子的转录水平，而SR-B1与配体的结合可活化蛋白激酶B，并同时抑制NF-κB的激活[15]，使得抗炎因子分泌增加[14]。当SR-B1介导的上述通路被阻断时，炎性细胞因子和活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生增多，过高的炎症和氧化应激水平最终可导致细胞凋亡。

作为抗炎的重要角色之一，糖皮质激素(glucocorticoid，GC)的合成也与SR-B1密切相关。小鼠体内的SR-B1缺陷可导致GC合成减少[16]，且Sophie等[17]通过实验证实，小鼠肾上腺皮质SR-B1的缺失可导致应激GC水平下降，全身炎症反应加剧，内毒素血症致死率显著上升。

另一方面，WT小鼠中的HDL关联蛋白，对氧磷酶1(paraoxonase 1，PON1)、血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activating factor acetylhydrolase，PAF-AH)等，可通过抑制LDL的氧化修饰达到抗氧化的作用。而SR-B1-/-小鼠血清中PON1和PAF-AH蛋白水平较WT小鼠均显著下降，PON1活性明显降低，且其体内脂质和蛋白氧化水平显著高于WT小鼠，证实SR-B1-/-小鼠体内氧化应激水平较WT显著升高[8]。

二、SR-B1-/-雌鼠的病理表现及其不孕的可能机制

1.SR-B1-/-雌鼠的激素水平缺陷：胆固醇是类固醇激素合成的主要原料[18]，SR-B1作为HDL受体，在调节类固醇合成细胞摄取高密度脂蛋白胆固醇(HDL cholesterol，HDL-C)，为激素合成提供原材料的过程中发挥重要作用[10]。基于此，“激素合成不足”假说被提出。

Trigatti等[19]发现SR-B1-/-雌鼠卵巢脂质的油红O染色显著弱于WT雌鼠卵巢，但交配相同天数后的SR-B1-/-与WT雌鼠血浆孕酮水平并无显著差异，且SR-B1-/-雌鼠的动情周期、排卵数目与对照组相比并无缺陷。随后，Jiménez等[20]对同时给予HCG促排卵处理的SR-B1-/-和WT雌鼠血浆孕酮水平进行检测，发现处于黄体期的SR-B1-/-雌鼠孕酮水平较WT雌鼠下降了约50%。

同年，Kolmakova等[21]构建了SR-B1缺陷的人颗粒细胞模型，检测其孕酮分泌及相关蛋白表达的水平。在各种培养条件下，SR-B1 Knockdown(SR-B1 KD)颗粒细胞的孕酮分泌水平均显著低于对照组颗粒细胞，且SR-B1 KD颗粒细胞中多种类固醇合成关键酶，如P450胆固醇侧链切除酶(P450 side-chain cleavage，P450 SCC)、3β-羟化类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3βHSD)、类固醇合成快速调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)，其RNA表达水平均显著下降。SR-B1可能通过调节StAR、SCC、3βHSD等多种类固醇合成途径中的关键蛋白的表达，从而影响颗粒细胞的孕酮分泌。

以上一系列的研究结果证实，SR-B1-/-雌鼠卵巢能够合成一定水平的类固醇激素以维持器官的一些基本功能，但在应激(促排卵)条件下，归因于激素合成关键酶的低表达或其他因素，机体能够动员利用的激素水平是相对不足的。

这种一定水平上的激素缺陷是否直接导致SR-B1-/-雌鼠不孕，Miettinen等[22]的研究对此做出了一个回复。研究人员以重组激活基因2敲除(reconstruction activating gene 2-/-，RAG-2-/-)的免疫耐受雌鼠为受体，手术切除其原卵巢后将SR-B1-/-雌鼠卵巢移植到其体内，再将其与WT雄鼠配对。术后的2～3周，SR-B1-/-卵巢移植的RAG-2-/-雌鼠中即有成功受孕鼠，最终妊娠率高达85.7%(6/7)。

在SR-B1正常表达的卵巢外环境中，SR-B1-/-卵巢可顺利产生功能性卵母细胞，并维持正常功能至成功妊娠。该项研究结果也从侧面证实，SR-B1-/-雌鼠不孕的原因不应仅局限于卵巢激素的合成缺陷，更多应该关注于紊乱的卵巢外环境。

2.SR-B1-/-雌鼠的失调性胆固醇代谢：在正常的RCT过程中，HDL中的FC在胆固醇脂酰转移酶(lecithin-cholesterol acyl transferase，LCAT)的作用下酯化为CE进而被细胞选择性摄取。上述胆固醇酯化的过程降低了体内FC的浓度，可有效地避免胆固醇过量蓄积引起的细胞功能障碍甚至凋亡或坏死的细胞毒性[23]。

SR-B1-/-小鼠体内RCT途径的受阻直接导致胆固醇代谢的一系列紊乱，具体表现为以FC升高为主的高胆固醇血症，其血浆游离胆固醇与总胆固醇(total cholesterol，TC)的比值(FC/TC)约为对照组两倍(0.5 vs. 0.25)，而作为决定该比值的关键因素，LCAT在SR-B1-/-小鼠肝脏的mRNA表达水平和血浆中的蛋白水平与WT相比均无显著差异[24]。针对LCAT活性的检测发现，SR-B1-/-小鼠LCAT内源性酯化活性显著低于WT水平[24-25]，但在加入外源性HDL-C的条件下，SR-B1-/-的LCAT外源性酯化活性与WT并无显著差异[25]。上述结果提示，SR-B1缺陷引起的HDL颗粒体积和成分的异常变化对于LCAT活性有很大影响，可进而导致FC向CE转化的酯化率降低，体内FC过量蓄积。

考虑到过量FC的细胞毒性与SR-B1-/-雌鼠不孕的可能联系，Yesilaltay等[25]构建了表达人LCAT的转基因SR-B1-/-小鼠模型(SR-B1-/-/LCATTg)对此进行研究。与非转基因组(SR-B1-/-)相比，转基因组小鼠LCAT外源性活性升高7～11倍，SR-B1-/-/LCATTg组FC/TC比值相比于SR-B1-/-组显著下降(0.37 vs. 0.44，P<0.001)，但仍比WT/LCATTg组值(FC/TC=0.18)高出约一倍。值得注意的是，SR-B1-/-/LCATTg组雌鼠的妊娠率(2/15)与SR-B1-/-组(0/7)相比具有显著差异。尽管SR-B1-/-雌鼠中LCAT的外源性活性升高近10倍只能部分改善其胆固醇酯化缺陷，但仍可有效地逆转不孕。

后期进一步的实验发现，SR-B1-/-雌鼠卵母细胞中FC水平远远高于WT雌鼠，且前者易发生过早激活，即在未受精的情况下，自动跳过减速分裂MII间期，排出第二极体。在体外胆固醇负荷的培养条件下，WT雌鼠卵母细胞出现了相同的现象[26]。

上述结果证实，过多的FC蓄积很有可能是造成SR-B1-/-雌鼠不孕的原因之一，而促进FC向CE的转化可有效逆转其不孕。

3.SR-B1-/-雌鼠的炎症与氧化应激：早有多篇文献报道，母体内的氧化应激水平可影响卵母细胞和胚胎质量，甚至可诱发多种妊娠并发症，如子痫前期、复发性流产等的发生[27]。

SR-B1缺陷引起的炎症、氧化应激与多种机制有关。除上述提及的促炎与抗炎因子的表达失衡、GC合成减少及抗氧化酶活性降低等因素外，SR-B1缺陷还可引起膳食成分中的抗氧化物(如β-胡萝卜素和α-生育酚)生物利用度下降[28]。α-生育酚(α-tocopherol，α-T)是脂溶性维生素E最具生物活性的形式，也是人体内最主要的抗氧化物之一。维生素E最早作为一种啮齿类动物正常生育所必须的微量营养素而被发现，且动物研究证实，在胚胎植入过程中回补维生素E可部分挽救由于维生素E缺乏所导致的不孕[29]。维生素E被肠上皮细胞所吸收，而这一过程有肠上皮细胞表面SR-B1的参与[28]。在循环中，LDL和HDL是α-T的主要运载体，细胞通过相应的脂蛋白受体摄取α-T[30]。相比于WT雌鼠，SR-B1-/-雌鼠血浆α-T的水平升高，但卵巢组织中α-T水平明显下降[31]。前期研究表明，SR-B1-/-雌鼠的不孕与其植入前胚胎的发育能力异常有关[19]。SR-B1-/-雌鼠卵巢内的低α-T水平可能加剧卵巢内氧化应激状态从而影响卵泡的正常发育，最终导致不孕。

在正常妊娠期间，母胎界面的母体面和胎儿面均有SR-B1的表达[32]。胚胎植入后的发育阶段中，母体循环中的脂蛋白α-T转运入胚胎的过程依赖于此界面中的SR-B1分子。已有研究证实，胚胎期维生素E的缺乏可引起胚胎宫内发育迟缓及出生后各种形态和功能上的异常[32-34]。SR-B1-/-小鼠胚胎在发育期间的α-T摄取不足甚至可导致神经管闭合障碍，最终引起胎鼠的围产期死亡[35]。SR-B1+/-杂合雌鼠与SR-B1-/-雄鼠配对后代中，SR-B1-/-仔鼠所占比例明显少于孟德尔遗传定律的50%，也就得到了合理的解释。

三、总结与展望

SR-B1-/-雌鼠的不孕可能涉及到多重机制。就激素水平而言，应激条件下的激素缺陷似乎并不能对此作出完全的解释；胆固醇代谢方面，通过促进SR-B1-/-雌鼠体内的FC向CE转化，可有效逆转其不孕，这一结果明确了过量FC蓄积可引起的生育毒性；此外，SR-B1-/-雌鼠体内异常升高的炎症与氧化应激水平可能干扰了卵母细胞和胚胎的正常发育，推动了不孕的发展。

SR-B1-/-雌鼠不孕的机制尚未完全明确，相关的机制假说仍需进一步的实验证实。对于临床不孕女性患者，可针对其SCARB1基因展开一定的检测，结合动物模型的相关实验数据，分析结果可能更有说服力。

针对SR-B1与女性不孕的相关研究为女性不孕的病因学提供了一个新的诊断方向，也为不明原因的不孕提供了一个新的治疗方向。