ProNGF-p75NTR在异氟醚暴露的老年小鼠认知功能下降中的作用*

孙满意，李　宁，马金凤，李克忠

(1山东大学第二医院，山东 济南 250033； 2青岛大学附属烟台毓璜顶医院，山东 青岛 264000)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是一种以认知能力下降为特点的临床综合征[1]。随着人口老龄化的加速以及手术覆盖率的上升，越来越多的老年人面临发生POCD的风险[2]。异氟醚(isoflurane，Iso)是一种临床常用的吸入麻醉药，研究证实经异氟醚暴露的老年小鼠出现认知功能下降，其机制可能与异氟醚诱导的神经细胞凋亡有关[3-4]。但是异氟醚引起细胞凋亡的具体机制尚不明确。

近年来，研究发现神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的前体(precursor form of NGF，proNGF)与其受体p75NTR特异性结合(proNGF-p75NTR),可以激活下游凋亡信号通路，诱导细胞凋亡[5-6]。而proNGF-p75NTR是否参与异氟醚诱导的老年小鼠中枢神经细胞凋亡，目前国内外尚未见报道。2-氨基-3-甲基-戊酸酰胺(LM11A-31，LM)是一种水溶性异亮氨酸衍生物，分子量为243.3 kD，是p75NTR受体特异性抑制剂[7-9]。本研究采用LM11A-31预处理拟行异氟醚暴露的老年小鼠，观察其对异氟醚诱导的认知损害和神经细胞凋亡通路的影响，探讨异氟醚介导的老年小鼠中枢神经毒性的相关机制，为寻找临床干预靶点提供实验基础和理论依据。

材　料　和　方　法

1　动物

IVC级C57BL/6J雄性老年小鼠30只，13～14月龄，体重30～35 g，购自山东大学实验动物中心(生产许可证：鲁20130009)。

2　主要试剂

异氟醚购自雅培制药有限公司；Morris水迷宫系统购自北京众实迪创；兔抗小鼠p75NTR、p-p38 MAPK和cleaved caspase-3抗体购自CST；兔抗小鼠proNGF抗体购自Alomone Labs； p75NTR抑制剂LM11A-31购自Ricerca Biosciences。动脉血气分析仪购自Abbott。

3　主要方法

3.1LM11A-31灌胃按照随机数表将30只老年小鼠随机分为3组：正常(control)组、异氟醚(Iso)组和异氟醚联合LM11A-31(LM+Iso)组，每组10只。参照文献[10]的方法并加以调整，将LM11A-31溶于无菌生理盐水中，并按照剂量 50 mg·kg-1·d-1对LM+Iso组老年小鼠进行灌胃，其余2组用等体积生理盐水灌胃，灌胃时间为1个月。

3.2异氟醚暴露灌胃结束后，将各组小鼠置于密闭麻醉箱中，使用气体监测仪持续监测箱内异氟醚、CO2和O2的浓度。麻醉箱底部浸于37 ℃的恒温水浴箱中。参照文献[11]的方法，将Iso组和LM+Iso组小鼠暴露于1%异氟醚3 h，异氟醚以空气(21%氧气混合79%氮气)输送，连续7 d； control组小鼠吸入空气3 h，连续7 d。

3.3生理指标监测第7天异氟醚暴露后15 min，记录小鼠呼吸频率。在麻醉结束时即刻，每组小鼠(n=10)经左心室心脏穿刺抽血行血气分析。

3.4Morris 水迷宫实验末次异氟醚暴露结束后24 h行Morris 水迷宫实验。在定位航行实验中，记录小鼠搜寻平台的逃避潜伏期。第4天训练完成后，行空间探索实验，此时平台从第Ⅰ象限移除，小鼠从平台放置象限相对的象限即第Ⅲ象限入水，每次小鼠进入游泳60 s后停止，记录目标象限穿越次数。

3.5Western blot 法测定蛋白表达水迷宫测试结束后，各组小鼠予腹腔注射20%乌拉坦1.2 g/kg 麻醉后断头，冰台上迅速分离海马组织，用匀浆法提取海马组织总蛋白。各组等量样本行5%～10%的SDS-PAGE，分离后的蛋白湿转至PVDF 膜上，使用5% 的脱脂奶粉封闭1 h，分别孵育相应 I 抗[兔抗小鼠p75NTR抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠p-p38 MAPK抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠cleaved caspase-3抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠proNGF抗体(1∶1 000)和兔抗小鼠β-actin抗体(1∶3 000)]，4 ℃孵育过夜。第2天用 TBST洗膜3次，加山羊抗兔 II 抗 (1∶4 000)，37 ℃孵育1 h后充分洗膜3次，采用ECL化学发光法显影，使用Fusion-FX7 Spectra凝胶成像图像分析系统进行免疫印迹膜的成像与电泳条带的半定量分析。

4　统计学处理

用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　生理指标监测

如表1所示，各组小鼠的pH值、氧分压(partial pressure of oxygen，PO2)、二氧化碳分压(partial pressure of carbon dioxide，PCO2)和血氧饱和度(arterial oxygen saturation，SaO2)值均在正常范围内。

表1生理指标监测
Table 1.The physiological monitoring indicators (Mean±SD.n=10)

GrouppHPO2(mmHg)PCO2(mmHg)SaO2(%)Control7．32±0．05245±2041．0±3．099．0±0．1Iso7．31±0．04240±2243．1±2．599．0±0．1LM+Iso7．34±0．03251±2143．7±3．299．0±0．1

2　小鼠海马组织中proNGF和p75NTR蛋白的变化

与control组比较，Iso组海马组织中的proNGF和p75NTR的表达水平显著增加(P<0.05)，见图1。

Figure 1.Western blot was used to determine the protein expression of proNGF and p75NTR.Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.
图1Westernblot检测proNGF和p75NTR的蛋白表达

3　小鼠海马组织中磷酸化p38 MAPK水平的变化

Iso组海马组织中p38 MAPK的磷酸化水平较control组显著升高(P<0.01)； LM+Iso组p38 MAPK的磷酸化水平较Iso组显著下降(P<0.01)，见图2。

Figure 2.Western blot was used to determine the protein levels of phosphorylated p38 MAPK (p-p38 MAPK) and cleaved caspase-3.Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsIso group.
图2Westernblot检测p-p38MAPK和cleavedcaspase-3的蛋白水平

4　小鼠海马组织中cleaved caspase-3的水平改变

Iso组海马组织中的cleaved caspase-3表达水平较control组显著升高(P<0.01)，而LM11A-31干预可以明显缓解异氟醚诱导的cleaved caspase-3蛋白水平的升高(P<0.01)，见图2。

5　小鼠行为学的改变

如表2所示，定位航行实验中，Morris水迷宫前2 d，各组小鼠的逃避潜伏期的差异无统计学显著性；从第3天开始，Iso组小鼠找寻平台的潜伏期明显长于control组(P<0.01)，而LM+Iso组小鼠的逃避潜伏期较Iso组小鼠显著缩短(P<0.01)。空间探索的实验结果可见，与control组相比，Iso组小鼠穿越原平台次数减少(P<0.01)；LM+Iso组小鼠穿越原平台次数较Iso组小鼠增加(P<0.01)，见表2。

表2　不同处理对Morris水迷宫实验结果的影响Table 2.The results of Morris water maze test (Mean±SD.n=10)

*P<0.01vscontrol group;#P<0.01vsIso group.

讨　　论

随着POCD在老年患者中的发病率逐渐增高，患者的生活质量受到严重影响，因此积极研究疾病机制以及寻找治疗靶点已成为目前亟待解决的问题。本研究发现，在老年小鼠中，异氟醚通过上调proNGF与其受体p75NTR的表达，激活下游p38 MAPK信号分子磷酸化，从而激活cleaved caspase-3凋亡级联反应。而p75NTR受体抑制剂LM11A-31可以显著下调以上凋亡信号相关分子，进而改善异氟醚诱导的老年小鼠认知功能下降。

NGF是神经营养因子家族中的一员，在中枢神经系统的病理生理活动中发挥了重要作用[12]。有研究报道，脑室内注射NGF可以促进大鼠海马区突触囊泡蛋白增加以及提高学习记忆能力[13]。NGF基因敲除小鼠表现出明显的胆碱能神经元丢失的特征[14]。生理情况下，NGF的前体proNGF在中枢神经系统较少表达，而在应激或疾病状态下，proNGF表达上调，参与神经退行性病变过程[15-18]。p75NTR属于跨膜I型蛋白，在神经系统广泛表达，proNGF通过与其特异性结合，介导神经细胞的凋亡发生[19]。有研究发现，阿尔茨海默病以及唐氏综合征等神经退行性疾病中，proNGF在大脑内大量沉积，影响胆碱能神经元供能，引起神经纤维缠结，导致神经元凋亡[7,14,16]。还有研究发现，高表达的proNGF通过p75NTR介导了癫痫大鼠模型海马神经元凋亡[18]。本研究发现，老年小鼠在异氟醚暴露后，proNGF以及p75NTR在海马组织中的表达显著上调，说明proNGF-p75NTR信号增强，很可能介导了异氟醚的神经毒性病理过程。

p38 MAPK磷酸化可以通过影响线粒体功能，从而激活caspase-3级联反应，增加cleaved caspase-3的蛋白水平，最终导致细胞凋亡[20-22]。有研究报道，糖尿病视网膜疾病中，proNGF通过激活下游p38 MAPK信号通路，介导视网膜细胞的凋亡发生[23]。本研究发现，p-p38 MAPK以及cleaved caspase-3的蛋白水平在异氟醚暴露的老年小鼠海马组织中升高，说明凋亡信号的激活可能与proNGF-p75NTR信号相关。我们进一步采用p75NTR特异性抑制剂LM11A-31以探讨proNGF-p75NTR在神经凋亡信号通路中的作用。结果发现，LM11A-31阻断p75NTR可以明显缓解p38 MAPK磷酸化水平以及cleaved caspase-3水平的升高，说明proNGF-p75NTR的激活参与了异氟醚介导的老年小鼠凋亡信号通路活化。另外，Morris水迷宫的行为学结果显示，LM11A-31干预可显著改善异氟醚诱导的老年小鼠认知功能下降，进一步说明proNGF-p75NTR信号通路的激活可能参与了异氟醚诱导的神经毒性反应。曾有研究表明，LM11A-31阻断p75NTR可以明显缓解阿尔茨海默病小鼠模型中的神经炎症、β淀粉样沉积以及tau蛋白磷酸化，最终提高小鼠的行为学成绩[7,10]。因此调控proNGF-p75NTR可能是改善异氟醚诱导的神经病变以及提高认知功能的潜在靶点。

综上所述，我们认为proNGF与其受体p75NTR特异性结合参与了异氟醚暴露的老年小鼠凋亡信号通路的活化以及认知功能下降的病理过程，这为寻找临床干预措施提供了理论基础。

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