三疣梭子蟹F型ATP酶β亚基(F-ATPaseβ)基因的克隆、组织表达及在家系近交中的变化*

王竹青 任宪云 高保全 刘 萍 张小辉 张 杰 于 旋



三疣梭子蟹F型ATP酶β亚基()基因的克隆、组织表达及在家系近交中的变化*

王竹青1,2任宪云2高保全2刘 萍2①张小辉1,2张 杰1,2于 旋2

(1. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306; 2. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071)

采用RACE技术(cDNA末端快速扩增技术)克隆获得三疣梭子蟹() F型ATP酶b亚基()基因，命名为。该基因cDNA全长为1965 bp，5¢和3¢非编码区分别为571 bp和341 bp，开放阅读框为1053 bp，推测编码350个氨基酸，预测分子量为 37.9 kDa，理论等电点为4.86。F-ATPaseβ氨基酸序列含有F1-ATPaseβ标志性蛋白结构域、AAA结构域和ATP-synt-ab-C结构域。同源性及系统分析显示，F-ATPaseβ氨基酸序列与斑节对虾()、凡纳滨对虾()同源性高达89%。实时荧光定量PCR显示，基因在肝胰腺、肌肉、心脏、鳃、胃、肠、精巢和卵巢中均有表达，其中，在肝胰腺和心脏中表达量最高，在肠中最少。随着近交系数的增加，各代基因的表达量在肝胰腺和心脏中均下降且显著低于F0代(<0.05)。酶活检测结果显示，心脏中的ATP合酶活性从F6代开始出现下降且显著低于F0代(<0.05)，但肝胰腺中ATP合酶活性无显著变化。本研究结果表明，近交造成了三疣梭子蟹基因表达及ATP合酶活力的衰退。

三疣梭子蟹；；基因克隆；表达分析；近交

ATP合酶又称F型ATP酶(F-ATPase)，广泛分布于线粒体内膜上，是生物体能量代谢的关键酶，在生物体内通过氧化磷酸化和光合磷酸化参与到ATP的合成过程(王镜岩等, 2002)。ATP合酶是一个蛋白质复合体，呈蘑菇状，分为球形的F1(头部)和嵌入膜内的F0(基部)。F1是由5种多肽组成的α3β3γδε复合体，具有3个ATP合成催化位点，而只有β亚基可催化ATP的合成反应。F0是由3个多肽组成的ab2c12复合体，并嵌入线粒体内膜(倪张林等, 2003)。ATP合酶β亚基在植物叶绿体和线粒体中的研究较多，证明其功能与植物体胚发育(赖呈纯等, 2010){赖呈纯, 2010 #101}、盐度适应(李敏等, 2013)、次生代谢(关蕾, 2013)等有关。在水产动物中对ATP合酶β亚基研究较少。Li等(2009)发现，ATP合酶β亚基与无脊椎动物造血激素存在特异性结合作用。徐萌霖(2013)发现，凡纳滨对虾()ATP合酶β亚基BP53蛋白可作为受体参与对虾白斑综合征病毒(WSSV)的感染，并证明了凡纳滨对虾造血激素和WSSV的粘附蛋白V37分别与ATP合酶β亚基存在特异性结合作用。

三疣梭子蟹()ATP酶的研究仅限于P型ATP酶，比如Na+/K+-ATPase酶和Ca2+/ Mg2+-ATPase酶，并证明其参与离子转运和渗透压调节等作用(周东等, 2014; 韩晓琳等, 2012; 江山等, 2011)。ATP合酶在三疣梭子蟹生长发育、能量代谢过程中发挥着重要的作用，但对三疣梭子蟹ATP合酶的研究尚未见报道，而且目前三疣梭子蟹亚基全长cDNA序列尚未被克隆。通过对本实验室三疣梭子蟹转录组数据库的分析与筛选，发现自交7代的大个体组相对于小个体组有2869个差异表达的基因。通过对差异基因开展进一步生物学进程KEGG富集分析，筛选出的差异基因富集的代谢通路主要有氧化磷酸化通路、细胞凋亡通路和对应外界刺激。因此，研究三疣梭子蟹ATP合酶对于深入研究其氧化磷酸化等代谢通路有着极其重要的作用。已有研究表明，近交能引起三疣梭子蟹能量代谢相关基因及代谢酶活力的衰退，但是否也能引起ATP合酶基因及酶活力的衰退还有待研究。

本研究利用RACE技术首次成功克隆得到三疣梭子蟹亚基基因的cDNA全长序列，命名为，并对得到的序列进行生物信息分析。利用实时荧光定量技术分析了该基因在三疣梭子蟹不同组织以及不同近交世代家系的肝胰腺和心脏中的表达情况。旨在明确三疣梭子蟹ATP合酶β亚基基因的表达特点，揭示近交程度对该基因表达及其酶活力的影响，为深入研究三疣梭子蟹能量代谢机制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

自2005年，本实验室每年将从山东莱州湾海区、辽宁鸭绿江口海区、江苏海州湾海区和浙江舟山海区获取的4个三疣梭子蟹不同地理群体作为基础群体，在中国水产科学研究院黄海水产研究所实验基地潍坊昌邑海丰水产养殖有限公司利用人工定向交尾技术，建立了全同胞兄妹交传代家系。良种家系留种传代，至2015年已传至11代(F11)。分别选取80日龄F0、F2、F4、F6、F8和F10近交世代家系的三疣梭子蟹，每代各取6只 (3只雌蟹、3只雄蟹)，暂养于室内水泥池中，水池底面积为20 m2，高度为1.5 m，池水深保持在20~30 cm，水温为(25.0±0.5)℃，溶解氧为5.5 mg/L，盐度为31，pH为8.2。暂养7 d，每日08:00定时换掉1/2的水，16:00投喂新鲜野杂鱼，投喂量为蟹体重的1/10。

1.2 三疣梭子蟹总RNA的提取及cDNA第一链的合成

三疣梭子蟹各组织的总RNA采用Trizol法提取，用核酸定量仪(Thermo, NanoDrop 2000)与1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其总RNA的质量及完整性。取等量所取各组织的总RNA混匀，合成3¢和5¢RACE的cDNA第一链，具体方法参照SMARTTMRACE Amplification Kit说明书。

1.3 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因全长cDNA的克隆及验证

根据从三疣梭子蟹转录组数据库得到的基因的EST序列，利用Primer Premier 5.0软件设计3¢和5¢末端特异性引物。根据克隆出的基因序列设计荧光定量引物。最后在该基因的两端设计正反向引物，进行全长cDNA的验证。实验中用到的末端特异性引物和荧光定量引物分别由青岛擎科梓熙生物技术有限公司和上海生工生物有限公司合成(表1)。利用TaKaRa LA进行末端扩增，3¢端用通用引物UPM和NUP分别与相应的特异性引物ATPase-F1和ATPase-F2进行巢式PCR扩增，PCR程序：94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 3 min，30个循环；5¢末端扩增同上。

表1 三疣梭子蟹克隆和mRNA相对表达分析所用引物序列

Tab.1 Primers used for ptF-ATPaseβ cloning and relative mRNA expression analysis

将3¢和5¢RACE的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，用NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up试剂盒(TaKaRa)切胶纯化并连接到pMD19-T，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在LB培养基中37℃培养45 min后，再将菌液涂布于含AMP的LB平板上，37℃过夜培养。挑取阳性菌落继续培养，并进行菌落PCR鉴定后送交青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序。最后利用在基因的两端设计的正反向引物，对其全长cDNA进行验证。

1.4 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因的生物学分析

使用ORF Finding在线工具确定基因最大开放阅读框和编码区。利用NCBI中的BLAST主页程序进行三疣梭子蟹基因的核苷酸和氨基酸序列的比对。利用CExpres和Gene Tool软件拼接比对核苷酸序列、去除冗余序列和翻译氨基酸。蛋白质理化性质预测、功能结构域分析、信号肽分析利用InterProScan和SMART等在线软件完成。利用DNAMAN进行F-ATPaseβ与其他物种的相应氨基酸序列的多重序列比对。利用MEGA 6.0软件，以邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育进化树进行聚类分析。

1.5 三疣梭子蟹线粒体的提取及ATP合酶活性测定

分别取不同近交世代家系的三疣梭子蟹肝胰腺、心脏，每2只螃蟹(1雌1雄)的组织放入一个冻存管中，存放于液氮中保存。用研钵将采集的组织样品在液氮中研磨，每个冻存管单独研磨，取100 mg左右的组织粉末加入2 ml EP管中，分别标记后放入-80℃冰箱中保存。

分别利用南京建成线粒体提取试剂盒和蛋白定量测试盒提取所取组织的线粒体并测定其蛋白浓度。使用ATP合成酶活性光谱法定量检测试剂盒在infinite 200酶标仪中分别测定不同世代家系三疣梭子蟹各组织ATP合酶活力，具体操作参照该试剂盒说明书进行。ATP合酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH=7.5条件下，每分钟内能够氧化1 mol还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量为1个活性单位。

1.6 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因的表达定量分析

分别取三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鳃、心脏、胃、肠、精巢和卵巢及不同近交世代家系的三疣梭子蟹肝胰腺、心脏等组织，每2只螃蟹(1雌1雄)的组织放入一个冻存管中，存放于液氮中保存。用Trizol试剂提取三疣梭子蟹所取组织的总RNA，利用核酸定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性，使用PrimeScript RT Reagent Kit反转录合成cDNA，具体方法参照试剂盒说明书。

根据已知的三疣梭子蟹基因cDNA全长序列，设计1对正反特异引物(QATPase-F和QATPase-R)(表1)。使用SYBR Premix ExⅡ试剂(TaKaRa)，在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR仪上分析各组织中基因的表达情况。PCR反应体系为10 μl，包括5 μl SYBR Premix ExⅡ、1 μl cDNA、0.4 μl浓度为10 pmol/μl正反向引物、0.2 μl ROX Reference dye Ⅱ和3 μl PCR反应水。反应程序：95℃ 10 min；95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃15 s。以β-actin基因为内参，样本和内参均设置3个重复，采用2-DDCt方法(Livak, 2001)计算基因的相对表达量。

1.7 数据分析

实验三疣梭子蟹ATP合酶活性及相对定量数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示；结果使用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan´s多重比较进行差异显著性检验，<0.05为差异显著。最后应用Origin 2016软件作图。

有些留学生希望能了解更多的临床知识，有的学生打算选择心脏儿科作为将来进一步学习和深造的方向，我们就利用课余时间让学生走进病房，尽可能多地介绍先天性心脏病的诊疗常规，给这些学生深入学习的机会。

2 结果与分析

2.1 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因全长cDNA的克隆及验证

三疣梭子蟹基因的EST序列长1692 bp，用BLAST对序列进行在线比对，结果显示，该序列与其他物种的基因的相似度在79%以上。3¢RACE扩增结果得到517 bp的cDNA片段，5'RACE扩增结果得到303 bp的cDNA片段。将这2个片段与已知EST序列进行拼接得到三疣梭子蟹基因的全长cDNA序列，并命名为。对该基因cDNA序列全长进行测序验证，结果显示，扩增出的大小为1745 bp的序列完全覆盖的开放阅读框(ORF)，表明得到的cDNA序列准确可靠。三疣梭子蟹基因的cDNA序列全长为1965 bp (GenBank登录号KY130458)，其中包含1053 bp的ORF，571 bp的5¢端非编码区(UTR)和341 bp的3¢端UTR，3¢端存在多聚腺苷酸Poly A尾(图1)。

2.2 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因序列的生物信息学分析

ExPASy ProtParam tool在线软件分析显示，三疣梭子蟹基因编码一个由350个氨基酸组成的蛋白质，理论等电点为4.86，分子量为37.9 kDa，推测其原子总数为5338，分子式为C1682H2675N447O524S10。该蛋白由18种氨基酸组成，包括甘氨酸(9.4%)、缬氨酸(9.1%)、丙氨酸(8.9%)、亮氨酸(8.3%)、丝氨酸(6.6%)、谷氨酰胺(6.6%)、异亮氨酸(6.6%)、苏氨酸(6.6%)、天冬氨酸(6.0%)、谷氨酰胺(5.4%)、精氨酸(4.3%)、赖氨酸(4.3%)、苯丙氨酸(4.0%)、脯氨酸(4.0%)、酪氨酸(3.4%)、蛋氨酸(2.9%)、天冬酰胺(2.3%)、组氨酸(1.4%)，带负电的氨基酸残基为44个(Asp和Glu)，带正电的氨基酸残基为30个(Arg和Lys)，亲水性平均数为–0.040，不稳定系数为39.45，属于稳定蛋白。SMART和SignalP 3.0在线软件分析表明，该蛋白质结构中无跨膜结构域和信号肽序列，且其第1~235位为F1-ATPaseβ标志性蛋白结构域(IPR005722)，其中，第23~207位为AAA(ATPases associated with a variety of cellular activities)结构域(IPR003593)，第243~348位为ATP-synt-ab-C结构域(IPR024034)(图2)。

图1 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因cDNA全长及其编码的氨基酸序列

ATG：起始密码子；*：终止密码子；阴影为P-loop-NTPase superfamily结构域；方框中为ATP-synt-ab-C superfamily结构域；下划线为ATP/GTP结合位点基序A (P-loop)；加粗斜体为ATP合酶α和β亚基特征位点

ATG: start codon; *: stop codon; Shadow: P-loop-NTPase superfamily domain; Block: ATP-synt-ab-C superfamily domain; Underline: ATP/GTP-binding motif A (P-loop); Bold and italic: ATP synthase α and β subunits signature

图2 三疣梭子蟹F-ATPaseβ蛋白结构域分析

InterProScan软件分析结果显示，F-ATPaseβ蛋白质存在5个蛋白激酶C磷酸化位点SSK、TTK、TSR、TAR和TIR，7个酪蛋白激酶II磷酸化位点SLND、TVAE、SMQE、SLQD、SEED、SLQD和SFEE，1个酪氨酸激酶磷酸化位点RGIAELGIY，8个N端酰基化位点GGKIGL、GLFGGA、GAGVGK、GVGKTV、GLTVAE、GSEVSA、GSITSV和GIYPAV，1个ATP合酶α和β亚基特征位点PAVDPLDSTS，1个ATP/GTP结合位点基序A(P-loop)GGAGVGKT。通过CLC Main Workbench 5.6软件分析其蛋白质二级结构含104个α-螺旋(27.91%)，169个无规则卷曲(48.29%) (图3)。

2.3 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因序列同源性分析及系统进化树分析

利用BLAST同源性分析三疣梭子蟹基因的氨基酸序列，发现其与斑节对虾()、凡纳滨对虾()同源性达到89%，与日本囊对虾()、中国对虾()、克氏原螯虾()、豌豆长管蚜()、玉带凤蝶()的同源性分别为88%、88%、87%、86%和86%(图4)。

利用MEGA 6.0软件对三疣梭子蟹F-ATPaseβ氨基酸序列进行系统进化分析，并构建系统进化树(图5)。结果显示，18个物种中，三疣梭子蟹与克氏原螯虾亲缘关系较近，与鱼类、哺乳类关系较远。在对虾中，斑节对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾和中国对虾紧密聚为一支，之后与三疣梭子蟹聚为一支。

图3 三疣梭子蟹F-ATPaseβ蛋白二级结构分析

蓝色代表α螺旋，红色代表延伸链，紫色代表无规则卷曲

Alpha helix is indicated by blue, extended strand is indicated by red, random coil is indicated by purple

图4 三疣梭子蟹F-ATPaseβ氨基酸序列与其他物种的F-ATPaseβ氨基酸序列比对

方框中为ATP合酶α和β亚基特征位点；圆方框中为ATP/GTP结合位点基序A (P-loop)；下划线为酪氨酸激酶磷酸化位点

Box: ATP synthase α and β subunits signature; Rounded rectangle: ATP/GTP-binding motif A(P-loop); Underline: Tyrosine kinase phosphorylation site

2.4 三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因在各个组织中的表达情况

采用实时荧光定量PCR方法，分析了三疣梭子蟹基因在各组织中的表达情况(图6)。结果显示，该基因在8个组织中均有表达，在肝胰腺、心脏和精巢中表达量最高，其次是胃、肌肉、鳃、卵巢，在肠中的表达量最少。

2.5 近交家系三疣梭子蟹ATP合酶活力及ptF-ATPaseβ基因的表达情况

三疣梭子蟹肝胰腺中的ATP合酶活性高于心脏中的活性，约是心脏中活性的2倍(图7)。随着近交系数的增加，心脏中的ATP合酶活性总体呈现显著下降趋势；F2和F4代心脏中的ATP合酶活性与F0代无显著差异，而从F6代开始ATP合酶活力出现下降且显著低于F0代(<0.05) (图7b)。而肝胰腺中的ATP合酶活性无显著变化(图7a)。

3 讨论

ATP合酶广泛存在于真核生物线粒体内膜、叶绿体类囊体、异养菌和光合细菌的质膜上，参与生物体氧化磷酸化和光合磷酸化作用，在跨膜质子动力势的推动下合成ATP，是生物体能量代谢的关键酶(王镜岩等, 2002)。ATP合酶主要由F1和F0组成，不同物种的ATP合酶所含的亚基及数目不尽相同。F1由亚基α3β3γδε组成，其中，β亚基是酶的催化核心，其构象的变化使它能够结合ADP和ATP，驱动着ATP的合成和水解(Boyer, 1989、1997)。β亚基不仅参与催化作用，它还可位于生物膜表面参与各种生理功能(Champagne, 2006)，因此，对三疣梭子蟹ATP合酶β亚基的研究对于其能量代谢的研究具有重要作用。目前，ATP合酶β亚基在植物叶绿体和线粒体中的研究较多，证明其功能与植物体胚发育、盐度适应、次生代谢等有关，而三疣梭子蟹ATP合酶的研究尚未见报道。

图5 MEGA 6.0软件采用邻接法构建的三疣梭子蟹与其他物种的F-ATPaseβ氨基酸的系统进化树

各物种基因登录号：斑节对虾(AEB92164.1)，凡纳滨对虾(ACB36913.1)，日本囊对虾(ACM91676.1)，中国对虾(ACM91675.1)，克氏原螯虾(ACU31053.1)，牡蛎(EKC39411.1)，沙漠蝗(AEV89780.1)，斑马鱼(NP_001019600.2)，鲤鱼(BAA82837.1)，果蝇(NP_001259081.1)，大型溞(JAN00926.1)，黑脉金斑蝶(EHJ67407.1)，牛(NP_786990.1)，家鼠(AAB86421.1)，黑猩猩(XP_003824956.1)，人(AAA51808.1)

GenBank accession numbers of different species:(AEB92164.1),(ACB36913.1),(ACM91676.1),(ACM91675.1),(ACU31053.1),(EKC39411.1),(AEV89780.1),(NP_001019600.2),(BAA82837.1),(NP_001259081.1),(JAN00926.1),(EHJ67407.1),(NP_786990.1),(AAB86421.1),(XP_003824956.1),(AAA51808.1)

图6 三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因在各组织中的表达情况

不同组织表达量均以与胃相比较的倍数表示。不同字母表示差异显著(<0.05)，下同

The expression in different tissues was presented as the fold compared to the level in the stomach. Different letters indicated significant differences (<0.05). The same as below

本实验克隆得到的三疣梭子蟹基因的cDNA序列全长为1965 bp。与其他动物编码区序列比对发现，三疣梭子蟹基因编码区保守性较强。该基因编码一个由350个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白具有F-ATPaseβ标志性蛋白结构域，无跨膜结构域和信号肽序列。该基因编码的蛋白氨基酸序列与斑节对虾、凡纳滨对虾F-ATPaseβ蛋白同源性达到89%，在系统进化中也与对虾科聚为一支，因此，对三疣梭子蟹基因表达及酶活性的研究可为其他海洋生物相关的研究提供参考。实时荧光定量PCR结果显示，三疣梭子蟹F-ATPaseβ基因在所研究组织中均有表达，在肝胰腺、心脏和精巢中表达量最高，说明三疣梭子蟹肝胰腺、心脏和精巢中的能量代谢比其他组织中旺盛，也证实了肝胰腺、心脏和精巢是三疣梭子蟹生长和发育主要供能中心。

图7 不同近交世代家系三疣梭子蟹肝胰腺(a)和心脏(b)中ATP合酶活力

图8 不同近交世代家系三疣梭子蟹肝胰腺(a)和心脏(b)中F-ATPaseβ基因相对表达量

由于三疣梭子蟹野生苗种的日益匮乏，苗种大多依靠人工养殖的亲本提供。然而，在苗种生产过程中不可避免地会造成群体内近交，从而导致了三疣梭子蟹种质资源的退化及遗传多样性的降低(王好锋等, 2013; Gao, 2015)。近交通常会使子代一些与繁殖力或生理机能相关的性状所表现的表型平均值降低(Frankham, 2001)，其程度可以用近交系数(F, coefficient of inbreeding)来表示。目前的研究已经证明，近交会造成水产动物形态学(Luan, 2014)、繁殖力(Moss, 2008)、存活和抗逆性(Luo, 2014)等表型性状方面的衰退，但关于近交对生理机制相关的影响还鲜有报道。Ren等(2016)证实了近交能够引起三疣梭子蟹酚氧化酶活力及抗氧化机制等生理机能的衰退。但目前有关近交对三疣梭子蟹能量代谢的影响还未见报道。

本研究结果还显示，随着近交系数的增加，心脏中ATP合酶活力呈现显著降低的趋势，说明近交引起了三疣梭子蟹心脏ATP活力的衰退，而ATP合酶β亚基基因相对表达量同样是逐代下降。研究表明，激活、过表达或敲降β亚基基因等会影响细胞内ATP的含量(李晶等, 2009)，因此，推测β亚基的下调表达造成了三疣梭子蟹心脏ATP合酶活性的下降。肝胰腺是三疣梭子蟹体内重要的器官，也是代谢最为活跃的组织，近交同样造成了三疣梭子蟹肝胰腺中ATP合酶β亚基基因相对表达量的衰退，但对其ATP合酶活力没有显著影响。细胞中某一蛋白在某一时间的表达受到多种因素的影响，如基因的转录、mRNA的翻译、蛋白质的降解速率等(Gygi, 1999)。尽管mRNA表达水平在一定程度上反映基因的表达，但近来越来越多的研究表明，mRNA表达水平并不能完全代表蛋白质的水平，而且蛋白还存在多种多样的翻译后加工修饰等(钱小红等, 2003; Simpson, 2006)。因此，我们预测三疣梭子蟹肝胰腺中的ATP合酶β亚基基因的表达与ATP合酶活力不一致可能与代偿机制或酶功效增强有关，还需同工酶和酶动力学研究进一步验证。

4 结论

本研究首次成功克隆三疣梭子蟹ATP合酶β亚基基因全长cDNA序列，该序列全长1965 bp，包含1053 bp核苷酸的ORF，编码一个由350个氨基酸组成的蛋白质。该基因与其他动物ATP合酶β亚基基因的核苷酸序列和预测氨基酸序列均有着比较高的同源性，可为其他海洋生物相关的研究提供参考。同时，利用实时荧光定量PCR技术检测了三疣梭子蟹基因的表达情况，表明该基因在组织中均有表达，且在肝胰腺和心脏中相对表达量最高。本研究还证明，近交造成了三疣梭子蟹基因表达和ATP酶活力的衰退，可为三疣梭子蟹的遗传育种工作提供参考数据。

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(编辑 冯小花)

cDNA Cloning and Expression Analysis ofSubunit Gene inand Its Variation in Family Inbreeding

WANG Zhuqing1,2, REN Xianyun2, GAO Baoquan2, LIU Ping2①, ZHANG Xiaohui1,2, ZHANG Jie1,2, YU Xuan2

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

A full-length cDNA sequence of F-ATPase β subunit gene from() was cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE). The sequence ofwas 1965 bp, containing a 571 bp 5' UTR, 341 bp 3' UTR, and a 1053 bp open reading frame (ORF) that encodes 350 amino acids polypeptides. The isoelectric point (p) was 4.86 and the molecular mass was 37.9 kDa. The amino acid sequence analysis demonstrated thatF-ATPaseβ has an F1-ATPaseβ domain, an AAA domain, and an ATP-synt-ab-C domain. Homology and phylogenetic analysis revealed that the amino acid sequence ofF-ATPaseβ shared a high similarity (89%) withand.mRNA level was detected in all tested tissues including the hepatopancreas, muscle, heart, gill, stomach, intestine, testis, and ovary. Thehad the highest level in the hepatopancreas and heart, and the lowest expression in the intestine. With the increase of inbreeding coefficient,expression decreased significantly in the hepatopancreas and heart (<0.05). The ATP synthase activity in the heart began to fall from F6generation and was significantly lower than F0generation (<0.05), but there was no significant change in the hepatopancreas. The results illustrate that inbreeding gradually reduces the expression ofand the ATP synthase activity in.

;; Gene cloning; Expression analysis; Inbreeding

LIU Ping, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2016-11-28,

2016-12-27

S917.4

A

2095-9869(2018)01-0097-10

10.11758/yykxjz.20161128001

http://www.yykxjz.cn/

* 国家自然科学基金面上项目(41576147)、泰山领军人才工程高效生态农业创新类计划项目(LJNY2015002)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(20603022015016)共同资助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (41576147), the Program of Shandong Leading Talent (LJNY2015002), and the Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes (20603022015016)]. 王竹青, E-mail: leon19910215@outlook.com

刘 萍, 研究员, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

王竹青, 任宪云, 高保全, 刘萍, 张小辉, 张杰, 于旋. 三疣梭子蟹F型ATP酶β亚基()基因的克隆、组织表达及在家系近交中的变化. 渔业科学进展, 2018, 39(1): 97–106

Wang ZQ, Ren XY, Gao BQ, Liu P, Zhang XH, Zhang J, Yu X. cDNA cloning and expression analysis ofsubunit gene inand its variation in family inbreeding. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 97–106