没食子酸衍生物的合成及抑菌活性研究

谭　平,刘斯宇,周太平,孙冬梅,彭长江，杜　波,任　丹,杨锡良,王周玉*(.西华大学理学院,四川　成都　60039；.成都新朝阳作物科学有限公司，四川　成都　60039)

众所周知，植物源农药由于其低毒、易分解、少残留、环境相容性好等特点，是生产无公害农产品优先选用的农药品种[1]；但是，该类农药具有防治效果缓慢、控制有害生物的范围较窄、产品质量稳定性较差等缺点。所以，利用植物源农药中活性较高的天然产物为先导化合物进行结构改造和优化，以保持其低毒、改善其活性是农业领域研究低毒新型农药的重要方向。

没食子酸亦称“五倍子酸”“棓酸”，广泛存在于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中，是一种天然的多酚类化合物，在食品、生物、医药、化工等领域有广泛的应用[2-22]。据国内、外文献报道，利用没食子酸为骨架结构修饰的研究很多；但主要集中在人用抗菌、抗肿瘤、消炎等药物的研发，将其结构修饰后用于农药的研究报道很少。国内除了李悦等[8]报道了3,4,5- 三羟基苯甲酸甲酯的抑菌特性及其对番茄青枯病的田间防治作用外，宋宝安等[18-20]将没食子酸的酚羟基和羧基同时进行了修饰，将改性后的没食子酸衍生物用于各种农作物的抑菌活性及抗病毒研究，取得了较好的研究结果。但到目前为止，还没有一个由没食子酸改性化合物取得农药登记证，所以，针对没食子酸改性衍生物在农业领域的应用还存在很大的研究空间。

本文采用廉价的没食子酸为原料，保留其酚羟基基团，衍生合成了4个新型化合物(图1：1，2a，2b，3)，同时考察了4种化合物对苹果斑点落叶病菌、苹果轮纹病菌、立枯丝核菌病菌以及马铃薯晚疫病菌的杀菌效果。

Reagents and conditions:(a)(CH3)2SO4,NaOH,H2O,100 ℃,4 h,82.1%;(b)CCl4,PPh3,Et3N,MeCN,12 h,80%;(c)SOCl2,DCM,rt,12 h,pyridine,MeCN,0 ℃,1 h,70%;(d)BBr3,DCM,rt,3 h,89.6%;(e)Me2S,AlCl3,DCM,8 h,rt,76.4%;(f)160 ℃～170 ℃,3 h,11%;(g)CF3COOH,DCM,40 ℃,12 h,94%;(h)NaBH4,MeOH,0 ℃,2 h,93%;(i)BBr3,DCM,rt,3 h,83%.

图1衍生物合成路线

1　实验合成部分

1.1　原料和仪器

1.1.1原料

没食子酸(成都瑞欧克科技有限公司) ;甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、氢氧化钠、浓盐酸、三苯基膦、乙腈、无水硫酸镁、间氯苯胺、硼氢化钠、二氯亚砜、吡啶、三氟乙酸、四氯化碳、三乙胺、三氯化铝(分析纯，成都科龙化工试剂厂) ;硫酸二甲酯(成都化夏化学试剂有限公司/北京公司);三溴化硼、二甲硫醚、二氨基硫脲、盐酸氨基脲(安耐吉化学)。

1.1.2仪器

1H NMR和1C NMR Bruker-400 MHz型核磁共振波谱仪；BSM-120.4电子天平；ZF-6型三用紫外分析仪。

1. 2　方法步骤

1.2.1N -(3 -氯苯基)-3,4,5-三羟基-苯甲酰胺的合成(1)

将没食子酸(8.5 g，50 mmol)，100 mL水加入带有冷凝回流管的250 mL四口瓶中，氮气保护，搅拌，加入氢氧化钠(4.8 g，120 mmol)及硫酸二甲酯(15.0 g，120 mmol)。10 min后再次加入硫酸二甲酯(15.0 g，120 mmol)，投料过程温度低于35 ℃，硫酸二甲酯加完后搅拌0.5 h。再加入氢氧化钠(4.8 g，120 mmol)，回流3 h。反应液冷却至室温后，用浓盐酸酸化至pH=2，抽滤得白色固体，用水重结晶，干燥，得8.7 g无色针状晶体M-1。

准确称取中间体M-1(0.64 g，3 mmol)、三苯基膦(1.89 g，7.2 mmol)加入一干燥的100 mL梨形瓶，以15 mL乙腈作反应溶剂使其溶解，冷却至0 ℃下，缓慢滴加四氯化碳(4.62 g，30 mmol)，滴加完毕在该温度下搅拌反应2 h。将间氯苯胺(0.255 g，2 mmol)和三乙胺(0.61 g，6 mmol)用2 mL乙腈溶解，缓慢滴加到反应液，滴加完毕继续在该温度下搅拌反应10 min，然后缓慢升温至室温直至反应完全。TLC检测反应情况，待反应完全后，减压浓缩后柱层析得0.77 g白色固体M-2。

以20 mL二氯甲烷溶解M-2(0.64 g，2 mmol)于一干燥的50 mL梨形瓶中，0 ℃下，缓慢滴加三溴化硼溶液(2.51 g，10 mmol)，滴加完毕，继续在该温度下搅拌反应10 min，然后缓慢升温至30 ℃反应3 h，TLC检测反应情况，待反应完全后，0 ℃下用预冷的甲醇(5 mL)淬灭反应，减压浓缩后柱层析得0.50 g白色固体1收率58.8%。

1.2.22-(3,4,5-三甲氧基苯基)-氨基脲的合成(2a和2b)

准确称取M-1(1.06 g，5 mmol)，取一干燥的100 mL梨形瓶，以50 mL二氯甲烷作反应溶剂使其溶解，0 ℃下缓慢滴加二氯亚砜(0.72 g，6 mmol)，加毕，室温下搅拌反应12 h。减压除去二氯甲烷，加入20 mL乙腈使其溶解，0 ℃下缓慢滴加至盐酸氨基脲(0.67 g，6 mmol)和吡啶(1.96 g，25 mmol)的乙腈溶液中(40 mL)，滴加完毕升温至室温反应1 h，TLC检测反应情况，待反应完全后，减压浓缩后柱层析得0.942 g白色固体M-3。

取一干燥的50 mL梨形瓶，0 ℃下将二甲硫醚(5.05 g，82 mmol)滴加到三氯化铝(1.96 g，6 mmol)的悬浮液中，准确称取M-3(0.81 g，3.0 mmol)，用二氯甲烷将其溶解，将M-3的二氯甲烷溶液滴加到二甲硫醚中，0 ℃下搅拌反应10 min，缓慢升温至室温直至反应完全。TLC检测反应情况，待反应完全后，用冰盐酸淬灭反应，减压除去溶剂，乙酸乙酯萃取(75 mL× 3)，收集有机层，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后柱层析得最终产品2。其中2a为黄色固体，收率44%，2b为灰白色固体，收率47%。

1.2.34-((3-氟苄基)氨基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H- 1,2,4-三唑-5(4H)-硫酮(3)

取一干净25 mL梨形瓶，准确称取M-1(2.12 g，10 mmol)，二氨基硫脲(1.06 g，10 mmol)加入反应瓶中，升温至160～170 ℃，待反应混合物熔融，在该温度下继续反应3 h，TLC检测反应情况，待反应完全后，反应混合物冷却至室温，加入少量热水洗涤，有白色絮状物析出，过滤收集该絮状物，干燥后无水乙醇重结晶得白色固体M-4(0.31 g，11%收率)。

（1）单列“税金及附加”总账科目，并在“业务活动表”中单列“税金及附加”项目，以核算、列示民非组织计提的各项流转税、附加税及其他税费。

取一干净50 mL梨形瓶，准确称取M-4(0.236 g，0.84 mmol)，间氟苯甲醛(0.114 g，0.92 mmol)，三氟乙酸(0.096 g，0.84 mmol)加入其中，20 mL二氯甲烷溶解，于40 ℃温度下回流反应过夜，TLC检测反应情况，待反应完全，减压浓缩后柱层析(二氯甲烷 ∶甲醇=30 ∶1)得白色固体M-5(0.31 g，94%收率)。

准确称取M-5(0.280 g，0.72 mmol)于一干净50 mL梨形瓶，以10 mL无水甲醇作为反应溶剂使之溶解，0 ℃下分批加入硼氢化钠粉末(0.40 g，10.8 mmol)，加毕，继续在该温度下搅拌反应2 h，TLC检测反应情况，待反应完全，0 ℃下滴加2 mL丙酮淬灭反应，减压浓缩后柱层析得中间体白色固体M-6(0.26 g，93%收率)。

以10 mL二氯甲烷溶解M-6(0.25 g，0.64 mmol)于一干燥的50 mL梨形瓶，0 ℃下，缓慢滴加三溴化硼溶液(0.88 g，8.32 mmol)，滴加完毕，继续在该温度下搅拌反应10 min，然后缓慢升温至30 ℃反应3 h，TLC检测反应情况，待反应完全后，0 ℃下用预冷的甲醇(5 mL)淬灭反应，减压浓缩后柱层析得白色固体最终化合物4，收率6.6%。

1.3　产物的结构表征

所有最终产物通过1H NMR、13C NMR和HRMS进行了结构表征，通过数据分析结构正确。

N -(3 -氯苯基)-3,4,5-三羟基-苯甲酰胺(1)的表征数据：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.07 (s, 1H), 9.10 (br s, 3H), 7.96 (s, 1H), 7.69 (d, J=7.84 Hz, 1H), 7.35 (t, J=8.04 Hz, 1H), 7.11 (dd, J=7.92, 1.68 Hz, 1H), 6.97 (s, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 166.26, 145.99, 141.58, 137.54, 133.31, 130.63, 124.99, 123.22, 119.90, 118.84, 107.74. HRMS (AP-ESI) Calcd. for C13H10ClNO4: 280.0377 (M+H)+. Found: 280.0374。

2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-氨基脲2a的表征数据：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.70 (s, 1H), 9.06 (br s, 3H), 7.70 (s, 1H), 6.87 (s, 2H), 5.89 (br s, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 166.93, 159.75, 145.85, 137.12, 123.35, 107.53. HRMS (AP-ESI) Calcd. For C8H9N3O5: 250.0440 (M+Na)+. Found: 250.0432。

4-((3-氟苄基)氨基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H- 1,2,4-三唑-5(4H)-硫酮(3)：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 13.77 (br s, 1H), 9.20 (s, 2H), 8.67 (s, 1H), 7.34 - 7.28 (m, 1H), 7.13 - 7.06 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.51 (t, J=5.80 Hz, 1H), 4.24 (d, J=5.68 Hz, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 166.36, 163.66, 161.24, 149.85, 146.25, 139.06, 136.24, 130.58, 125.60, 116.37, 116.16, 115.68, 115.02, 114.81, 107.40, 52.49. HRMS (AP-ESI) Calcd. for C15H13FN4O3S: 349.0771 (M+H)+. Found: 349.0767。

2　抑菌活性的测定

2.1　原料与仪器

原料：苹果斑点落叶、苹果轮纹、立枯丝核菌、草莓炭疽、马铃薯晚疫真菌(成都新朝阳作物有限公司)；葡萄糖、琼脂、二甲亚砜、吐温80(成都市科龙化工试剂厂)。

仪器：SGSP-02恒温隔水式培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)；BHC-1300 A2SPX-150-Ⅱ生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)；JA2003N电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；YAIB湿热灭菌锅(上海博讯实业公司医疗设备厂)。

2.2　实验步骤

采用生长速率法测定没食子酸衍生物对苹果斑点落叶病菌、苹果轮纹病菌、立枯丝核菌病菌、草莓炭疽病菌、马铃薯晚疫病菌的抑菌活性。

1)制作PDA培养基：马铃薯先洗净去皮,再称取200 g切成薄片，加水煮烂(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，加热，再加18 g琼脂(边加边搅拌，直到完全溶解)，加入20 g葡萄糖，搅拌均匀，补足水分至1 000 mL，分装锥形瓶，封口，高压灭菌锅(121 ℃)灭菌30 min后备用。

2)本实验每个浓度设置3个重复，以加入等量的溶剂为空白对照。实验药剂质量分数为1×10-4。分别取药剂1 mL于培养皿中，加入9 mL PDA培养基，轻轻摇匀，做好标记，水平放置到冷却。用打孔器在扩繁成功的培养基内，按同心圆周打孔。再接种到培养基的中心，倒置于培养箱内。空白对照菌圈直径为培养皿直径的2/3左右，测各个处理的菌圈直径。在空白菌丝长至扑满2/3平板时，采用十字交叉法测定菌落直径，计算平均直径大小，计算药剂抑菌率。

抑菌率计算公式：I=[(D0-Dt)/(D0-4)]×100%。

I为菌丝生长抑制率；D0为空白菌落直径；Dt为药剂处理菌落直径(农药室内生物测定试验准则杀菌剂 NYT1156.2-2006)。

2.3　抑菌活性结果

从表1可以看出4个化合物对苹果斑点落叶病菌和苹果轮纹病菌都有一定的抑菌活性，特别针对苹果轮纹病菌，改性后的衍生物效果都优于没食子酸，抑制率分别为49.0%、42.4%、48.1%以及51.3%。衍生物2b和3对立枯丝核菌的抑制率优于没食子酸，分别为35.4%和33.7%。4个衍生物对于马铃薯晚疫病菌没有效果。

表1　衍生物1、2a、2b和3的抑菌活性

3　结论

本文以没食子酸为原料衍生合成了4个新化合物，经过氢谱、碳谱和质谱进行了结构鉴定。同时对其抑菌活性进行了初步筛选。4个化合物都对苹果斑点落叶和苹果轮纹有一定的抑菌活性，衍生物2b和3对立枯丝核菌和苹果轮纹病菌的抑制率高于没食子酸。

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