不同生长期蓝莓叶多酚物质含量及抗氧化活性研究

李晓英，薛 梅，樊汶樵，黄 科

（重庆文理学院a.林学与生命科学学院；b.特色植物研究院，重庆 永川 402160）

蓝莓（blueberry）在我国有着十分丰富的资源，目前重庆已有多处蓝莓种植基地。蓝莓叶作为蓝莓种植的副产物具有巨大的开发利用价值。许多研究结果表明，蓝莓叶中的酚类化合物具有抗氧化、抑菌、改善血液循环、生物防御[1-3]诸多生物活性，其风味独特，营养和保健价值均高[4-6]，其多酚含量及部分抗氧化性能均高于其果实，可作为茶饮用，亦可入药[7-8]，很多商家把蓝莓叶直接烘干作为茶出售，亦有人研制成保健茶[9]。Harris 等[10]利用高效液相色谱质谱仪分析检测矮丛蓝莓根、茎、叶和果实中的酚类物质，结果得出，蓝莓叶提取物中的绿原酸含量最高，约为100 μg·mg-1；LI Chunyang等人[11]研究发现，兔眼蓝莓叶的乙醇提取物中多酚类物质含量较高，且抗氧化能力强于兔眼蓝莓果；Turhan 等[12]对蓝莓果和蓝莓叶中的多酚含量进行了比较分析，结果表明，蓝莓叶中的多酚含量高于蓝莓果，且蓝莓叶多酚清除DPPH 自由基的能力和还原能力均强于蓝莓果。Ehlenfeldt 等[13]对81 种蓝莓的研究结果表明，蓝莓叶中多酚的平均含量为44.80 mg·g-1，其对超氧自由基的清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）的平均值为490 μmol·g-1，远高于蓝莓果实（其分别 为1.79 mg·g-1、15.9 μmol·g-1）。WANG S Y 等人[14]在对蓝莓、树莓、草莓和黑莓的果实和叶片的研究中发现，其叶片比果实均有更高的价值，果 实 中ORAC 值 的 范 围 为35.0～162.1 μmol·g-1（干物质），而叶片中ORAC 值的范围为205.0～728.8 μmol·g-1（干物质），随着树叶变得衰老，其ORAC 值和总酚含量均下降。

蓝莓叶含水较多，对其开发利用必须在采摘后立即进行干燥处理。微波干燥技术具有干燥速率大、生产效率高、清洁生产、易实现自动化控制等优点，且不影响被干燥物料的色、香、味及有效成分，可起到灭酶、杀菌的作用，在需要干燥处理的各个生产领域越来越受到重视[15-16]。有关不同生长期蓝莓叶的多酚含量及其功能活性方面的研究报道很少，国内仅见到杨贵云等[17]对5、6月蓝莓叶中总酚含量的比较研究报道，其研究结果表明，以乙醇提取法得到的总酚含量及其对DPPH 自由基的清除能力，5月大于6月（南金品种），而南大品种则与之相反；国外仅见Routray等[18]对北美高丛蓝莓叶在不同生长期其总酚、花青素的含量及抗氧化能力进行了研究。基于此，本实验在比较分析微波与传统干燥法对蓝莓叶总酚和总黄酮的影响情况的基础上，采用较好的干燥方法对不同生长时期采摘的蓝莓叶进行干燥处理，测定其酚类物质的含量及抗氧化活性，以期为蓝莓叶的适时采摘并进一步综合开发与利用，提高蓝莓种植的经济价值提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓叶：南金3#（兔眼高丛蓝莓），采自重庆市永川区五间种植基地。分别于5月初（新生枝条，长出数十叶片）、6月底（花蕾开始凋谢，初见小果）、8月初（蓝莓果实采摘之后）、9月底（当年新枝生长季末，叶片颜色发生改变）此4 个生长时期采集无虫蛀、无机械损伤、色泽鲜亮的新鲜蓝莓叶，均平铺为一层，分别采用自然干燥、微波干燥（微波输出功率800 W，每次干燥1 min，间歇干燥10 次）、常规热风干燥（鼓风，温度50 ℃）方法处理样品，至其含水量均低于8%时，粉碎后过60 目筛，密封，置于-80 ℃的冰箱中保藏。使用前，将样品置于干燥器中平衡过夜。

芦丁、没食子酸（纯度在95%以上），美国Sigma 公司；VC标准品、DPPH，上海金穗生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ），南京都来生物有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2104 电子天平，上海精科天平有限公司；RZ-50 高速微量离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；RRH-200 型高速多功能粉粹机，上海缘沃工贸有限公司；754 型紫外可见分光光度计，上海舜宇恒平开学仪器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 蓝莓叶醇提物（ethanol extraction of blueberry leaf，EEBL）的制备

称取0.5 g 左右蓝莓叶粉末（精确到0.001 g），以料液比为1 ∶100（m∶V）的比例，分别加入50 mL 酸化甲醇水溶液（VHCl∶V70%甲醇＝0.1 ∶100.0），在40 ℃条件下水浴超声提取30 min，放冷，用70%的酸化乙醇补足减轻的质量。以4 000 r·min-1的转速离心10 min，取上清滤纸过滤后即得10 mg·mL-1（以蓝莓叶质量计的醇提物质量浓度）的醇提物，装入棕色瓶中，于4 ℃条件下保存以备用。

1.3.2 总酚含量的测定

参照（有所改进）Cai Yizhong 等人[19]的福林-酚法进行测定。分别取样液1 mL，加入1 mL 的福林-酚试剂，用7.5%的碳酸钠水溶液定容至25 mL，混匀后在室温条件下静置4 min，在暗处放置2 h 后，取上清液，然后用分光光度计在750 nm 波长处测定其吸光度。以没食子酸为标准品在相同条件下测定吸光度，得到的标准曲线方程如下，结果以没食子酸当量（mg·g-1，以干质量计，下同）表示：

y＝3.989 0x＋0.091 3，R2＝0.999 2。

1.3.3 总黄酮含量的测定

采用Chun 等人[20]改良的比色法进行测定。分别取样液1 mL，加入5%的亚硝酸钠水溶液1 mL，混匀，6 min 后加入10%的硝酸铝水溶液1 mL，6 min 后加入0.04 g·mL-1氢氧化钠水溶液10 mL 并混匀，用去离子水定容至25 mL，静置15 min，将反应液充分混匀，15 min 后，取上清液在510 nm 波长处测定吸光度。以芦丁为标准品，在相同条件下测定吸光度，得到的标准曲线方程如下，结果以芦丁当量（mg·g-1）表示：

y＝0.477 2x＋0.040 6，R2＝0.999 8。

1.3.4 还原力的测定

采用Venkatachalam U 等人[21]的方法进行测定。在试管中依次加入2.5 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS，0.2 mo1·L-1、pH值为6.6），分别量取不同生长期的EEBL、抗坏血酸溶液各1 mL，再分别加入1%铁氰化钾溶液2.5 mL 混匀，于50 ℃水浴保温20 min 后快速冷却，再加入10%的三氯乙酸溶液 1 mL，以5 000 r·min-1的转速离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入蒸馏水2.5 mL、0.1%的FeCl3溶液0.5 mL，充分混匀，静置10 min 后，在700 nm 波长处测定吸光度（A），铁还原能力用吸光度表征，以提取剂的吸光度作为空白值（A0）。

铁还原能力＝A－A0。

1.3.5 清除DPPH 自由基能力的测定

采用李晓英等人[22]改良的方法进行测定。分别取不同浓度的EEBL 各 2 mL 加入试管中，加入0.2 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液2 mL，混匀，在避光条件下反应30 min，于517 nm 波长处测定其吸光度（A1）；将2 mL 的EEBL 分别与2 mL 的无水乙醇混匀反应后测定其吸光度（A2）；再将2 mL 的DPPH 和70%的乙醇溶液（酸化）2 mL混匀反应后测得其吸光度（A2）。按照下面的公式计算样品对DPPH 自由基的清除率（%）。

清除率(%)＝[1－(A1－A2) /A2]×100%。

半数清除浓度（median elimination concentration，EC50）为清除50%的自由基所需样品的质量浓度，可通过已获得的DPPH 自由基清除率的回归方程计算所得；以待测样品的质量浓度为横坐标（X），以清除率为纵坐标（Y），得到待测样品对DPPH 自由基的清除率的关系曲线，据此曲线方程可计算得到待测样品的EC50值。

1.3.6 总抗氧化能力的测定（FRAP 法）

参照卢引等人[23]的方法进行测定。取TPTZ溶液（用40 mmol·L-1的盐酸配置）10 mmol·L-1、氯化铁20 mmol·L-1和pH 值为3.6 的醋酸钠缓冲液0.3 mol·L-1，将此3 种溶液按1 ∶1 ∶10 的比例混合后制成现配现用的FRAP 工作液。分别吸取不同浓度的EEBL 各0.3 mL 加入试管中，再分别加入3 mL 的工作液，于70 ℃下反应10 min，测定593 nm处的吸光度，并且以VC作为阳性对照。同时，配制浓度为0.05～0.40 mmol·L-1的硫酸亚铁标准溶液以制作标准曲线，得到的回归曲线方程为：

y＝1.704 4x＋0.113 7，R2＝0.998 6。

以所测吸光度值对应的硫酸亚铁毫摩尔数表示样品总抗氧化活力的FRAP 值。

1.3.7 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 不同干燥方法对蓝莓叶酚类物质含量的影响

采用自然干燥、常规热风干燥和微波干燥这3 种方法对4 个生长时期的蓝莓叶分别进行干燥处理，并采用乙醇提取酚类物质，测定并计算得到总酚和总黄酮含量，结果见图1。由图1可知，不同干燥方法对蓝莓叶中总酚、总黄酮的含量均有不同程度的影响。微波干燥法对蓝莓叶酚类物质的影响最小，其次是热风干燥，自然干燥的效果最差。以热风干燥法处理的蓝莓叶其总酚含量与以微波干燥法处理的相当，仅在5月时存在显著差异（P＜0.05），这可能因为这个时期的叶片含水量较高，热风干燥处理时间较长，导致酚类物质被氧化。以微波干燥法处理的蓝莓叶在4 个生长期其总黄酮含量均大于热风干燥处理的样品，且每个生长时期的总黄酮含量间均存在显著差异（P＜0.05），说明微波快速干燥处理能较好地保留原材料中的活性成分，因此以下实验样品均采用微波干燥方法进行处理。

图1 不同干燥法对不同生长时期蓝莓叶中总酚和总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of different drying methods on total phenolic and total flavonoid contents in blueberry leaves during different growth periods

2.2 不同生长期蓝莓叶醇提物铁还原力的比较

还原力的测定是检验样品是否为良好的电子供体的方法，还原力强的样品是良好的电子供应者，其供应的电子不仅能使Fe3+还原为Fe2+，也可以与自由基反应[24]。不同生长期蓝莓叶醇提物的铁还原力见图2。从图2中可以看出，不同生长期蓝莓叶醇提取物（EEBL）的铁还原能力随着其质量浓度的提高而升高，当EEBL 的质量浓度在0.625～2.500 mg·g-1的范围内，EEBL对Fe3+还原力的升高趋势较为明显，而当EEBL的质量浓度大于2.500 mg·mL-1后其增幅较小；当其质量浓度达到最高（10.000 mg·mL-1）时，VC的铁还原能力大于嫩叶，除此之外，其他情况下嫩叶提取物的铁还原力均大于其他生长时期蓝莓叶及VC的还原力，在测定的浓度范围内，5月EEBL 的铁还原力与6、8、9月EEBL 的铁还原力间存在显著差异（P＜0.05）；6月和9月的铁还原能力基本相当，总体大于8月蓝莓叶醇提物的铁还原能力，且在2.500～10.000 mg·mL-1的范围内与8月蓝莓叶醇提物间存在显著差异（P＜0.05）。

图2 不同生长期蓝莓叶醇提物的铁还原力Fig.2 Reducing ability to Fe3+ of ethanol extraction of blueberry leaves during different growth periods

2.3 不同生长期蓝莓叶醇提物清除DPPH 自由基能力的比较

DPPH 是一种稳定的自由基，广泛用于测定生物试样、酚类物质和食品的抗氧化能力，常用来评估抗氧化物的供氢能力[25]。不同生长期蓝莓叶醇提物（EEBL）对DPPH 自由基的清除率见图3。

图3 不同生长期蓝莓叶醇提物对DPPH 自由基的清除能力Fig.3 Scavenging capability to DPPH radicals of ethanol extractions of blueberry leaves during different growth periods

由图3可知，随着蓝莓叶醇提物的质量浓度的升高，其对DPPH 自由基的清除能力也升高，且在12.5～100.0 μg·mL-1的浓度范围均有较好的剂量—效应关系，其相关系数R2均在0.94～0.99 之间，但当其质量浓度为100.0～200.0 μg·mL-1时，5月和6月采摘的蓝莓叶EEBL 对DPPH 自由基的清除能力的变化趋势均明显，而8、9月采摘的蓝莓叶醇提物及VC对DPPH 自由基的清除能力的增幅却均变缓。在相同浓度下，总体上看，5、8 及9月此3 个生长时期采摘的蓝莓叶EEBL 对DPPH 自由基的清除能力相当，而6月的相对较低，当EEBL 的质量浓度为50～200 μg·mL-1时，6月与其他生长时期及VC的清除率间呈显著差异（P＜0.05）；当EEBL浓度最低（12.5 μg·mL-1）时，VC对DPPH 的 清除能力最弱，且其与所有生长期蓝莓叶EEBL对DPPH 自由基的清除能力间均存在显著差异（P＜0.05）。5、8 和9月采摘的蓝莓叶其EEBL 的EC50值相当，分别为 （62.04±1.34）（63.12±1.38）（61.59±1.31）μg·mL-1，而6月的EC50值最大,为（96.31±2.08）μg·mL-1；4 个生长时期蓝莓叶EEBL 的EC50值均大于对照品VC，VC对DPPH 自由基的EC50值为（57.46±1.20）μg·mL-1。

2.4 不同生长期蓝莓叶总抗氧化能力的比较

测定总抗氧化能力的FRAP 法即“亚铁还原能力实验”，是一种在低pH 值的条件下利用亚铁离子与TPTZ 生成蓝紫色复合物来测量样品抗氧化能力的实验，广泛运用于食品与保健品的抗氧化能力分析之中[23]。FRAP 值的大小代表着抗氧化能力的强弱，数值越大则说明抗氧化能力越强，不同生长期蓝莓叶醇提物的FRAP 值见图4。

图4 不同生长期蓝莓叶醇提物的总抗氧化能力（FRAP 值）Fig.4 Total antioxidant capacity (FRAP values) of ethanol extractions of blueberry leaves during different growth periods

由图4可知，随着蓝莓叶醇提物质量浓度的提高，FRAP 值也逐渐增大，4 个生长期蓝莓叶醇提物的FRAP 值均小于VC溶液的FRAP 值。在4 个生长期蓝莓叶醇提物的FRAP 值中，9月的FRAP 值最大，6月的最小，当其醇提物的质量浓度在40～100 μg·mL-1的范围内时，9月与6、8月的FRAP 值间均存在显著差异（P＜0.05）。将9月的FRAP 值与5月的FRAP 值进行比较，当醇提物的质量浓度在低浓度范围内时，两者间存在显著差异（P＜0.05）；而当醇提物的质量浓度在高浓度（80～100 μg·mL-1）范围内时，两者间的差异却不显著。5月嫩叶醇提物的FRAP值在其低浓度范围内时小于6月和8月的；但当其在高浓度（80～100 μg·mL-1）范围内时，其FRAP 值与6月和8月的FRAP 值间均存在显著差异（P＜0.05）。但是，8月的FRAP 值总体上高于6月的FRAP 值。

3 讨论与结论

随着我国蓝莓种植业的不断发展，可利用的蓝莓叶资源日益丰富。植物多酚是植物的次生代谢物，广泛存在于植物体内，诸多研究结果都表明，蓝莓叶多酚含量高于其果实和花[1-3,22]，因此，对蓝莓叶的开发利用有利于提高蓝莓种植业的经济效益。随着蓝莓生长时间的延长蓝莓叶中总黄酮、总酚的含量均逐渐升高，5月和6月的总酚含量基本相当，但果实采摘后蓝莓叶中的总黄酮含量开始明显升高，8月总黄酮含量为72.52 mg·g-1，显著大于6月的总黄酮含量（52.72 mg·g-1），到9月可达96.76 mg·g-1，极显著高于前3 个生长时期的。这与李晓英等人[22]对蓝莓花与嫩叶、老叶中的总黄酮及总酚含量的比较研究结果基本吻合，蓝莓花中的黄酮含量是多酚含量的2 倍多，而嫩叶中黄酮的含量是多酚的1.5 倍左右，老叶中的黄酮含量又接近多酚含量的2 倍。Routray 等[18]对两个品种蓝莓叶在不同生长期的多酚及花青素含量变化情况的研究结果也表明，5月二者的含量均较高，之后均降低，到9月才均基本回升到5月的含量水平。此研究结果表明，蓝莓在从自然生长到成熟的过程中，叶片中的总酚、总黄酮含量均增加，且总黄酮含量高于总酚含量，总黄酮含量在蓝莓成熟采摘之后迅速升高，老熟叶片中的总黄酮含量最多。这一结果说明，5月蓝莓开花前，酚类代谢产物积累于蓝莓叶中；花开和着果时，多酚和黄酮在花和果实中积累，且黄酮类物质的积累多于多酚类物质，这可能因为，蓝莓叶中的酚类物质部分向花和果实中转移，及至6—7月，高温、气体分压低等不利生长环境造成这个时期蓝莓叶次级代谢活动的减弱[26-27]，从而使得总酚类物质含量有所减少或持平，果实采摘后则开始增加。有关学者对忍冬叶[28]、桃树叶[29]、桑叶[30]、山杏叶[31]等在不同生长期的生物活性物质的研究结果表明，6月采摘的忍冬叶其绿原酸等酚类物质的含量最高，桃树嫩叶和9月底到10月初桃子采收后其叶片中的黄酮含量高，而桑叶中黄酮含量的变化不大，仅在10月后明显下降；落叶期山杏叶中总三萜酸、桦木酸、齐墩果酸和熊果酸等生物活性物质含量均高于非落叶期。徐友等人[32]的研究结果表明，2年生盆栽银杏叶中黄酮类化合物的合成与增量存在显著的光强效应和温度、光强的交互效应。这一研究结果说明，酚类物质代谢及基因表达是一个复杂的过程，不同品种、不同栽培期及不同月份，园林植物叶片中的酚类物质含量均随之变化。

不同生长期植物叶片的活性物质含量及抗氧化能力与植物品种有关，但其功能活性最高的时期均是在其花或果实采摘之后的一段时期。吴丹丹等[28]采用HPLC 法对不同生长期忍冬叶中的绿原酸、木犀草苷、芦丁等9 种化合物的含量进行了测定，并对其抗菌活性进行了研究，结果表明，忍冬叶6月所测的各种活性成分含量均较高，且其抑菌效果最好，而6月正值忍冬花采摘（一般4、5月采摘）后的1 个月左右。本研究结果表明，不同生长期蓝莓叶醇提取物提供电子的还原能力的大小顺序为5月＞8月≈9月≈VC＞6月；其对DPPH 自由基的清除能力，6月的最低，其余3 个生长时期的均极显著强于6月的，且与VC的相当；其总抗氧化能力即FRAP 值的大小顺序为9月＞5月＞8月＞6月，均极显著低于VC。由此说明，各生长期蓝莓叶醇提取物对DPPH 自由基的清除能力均较强，而其还原能力均相对较弱，这与TURHAN 等人[12]的研究结果类似；Routray等人[21]的研究结果也显示，不同季节蓝莓叶对DPPH 自由基的清除能力和FRAP 值的大小顺序均为10月＞9月＞5月＞7月，这与本研究结果也基本一致，说明蓝莓叶的抗氧化活性受季节的影响，这可能是在不同的季节，环境条件的不同导致其次生代谢能力不同，其所生成的代谢物质的含量也不同，而活性物质的含量与其抗氧化能力间存在量效关系[33]。植物叶片中活性物质的含量不仅与其抗氧化能力有关，而且与植物叶片的抑菌及抗病力有关[34]。王明等人[35]通过调查、统计和分析，建立了9 种园林植物叶片的抗病虫害能力与叶片中总多酚含量的关系的数学模型，结果表明，叶片中的多酚含量越高，其抗病虫害能力就越强。

综合不同季节蓝莓叶醇提取物的酚类物质含量和抗氧化能力分析可知，开花期和着果期不适于蓝莓叶的采摘及对其活性物质的利用，较适宜的采摘与利用时期应为9—10月，春梢上的蓝莓叶尽管也有较高的酚含量和较强的功能活性，但不适于大量采摘。当然，本研究仅针对4～5 个月采摘的1 个品种的蓝莓叶进行了探讨，显然存在一定的局限性，今后可对不同树龄、不同品种在一年之内其叶片酚类物质的含量变化情况进行深入的研究。