维药野西瓜醇提物的镇痛作用研究

黄先菊，柯才华，李　梅，陈　慧，袁　琳，*

(1 中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 中南民族大学 实验教学与实验室管理中心，武汉 430074)

野西瓜(CapparisspinosaL.)为白花菜科山柑属植物，又名槌果藤、老鼠瓜、刺山柑，在我国主要分布于新疆、甘肃和西藏等地，在国外分布于环地中海及西亚的一些国家[1]. 野西瓜是维吾尔医常用药材，具有清除体内异常体液、畅通阻滞等功效.维药野西瓜其根、果、叶均能入药，功能祛风除湿，止痛消肿[2,3]. 应用多种炎症模型对其醇提物抗炎镇痛作用进行了实验研究，并初步探讨了其作用机制，以期为进一步开发野西瓜在抗类风湿新药研究上提供实验依据.

1　材料与仪器

1.1　实验动物

SPF级昆明小鼠(18～22 g) ;购自湖北省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2008-0005. 饲养于中南民族大学药学院SPF级动物房，严格按照《湖北省实验动物质量控制标准》进行，动物房温度为 (22±2) ℃，光照或黑暗条件下让老鼠自由进食. 为避免食物干扰，动物在实验前12 h停止喂食，只供水.

1.2　药材与试剂

野西瓜果系购于新疆的药材干品，经鉴定为白花菜科山柑属植物野西瓜的果实. 阿司匹林泡腾片(中国阿斯利康制药有限公司)，吗啡注射液(中国东北制药集团)，冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)，其他试剂均为分析纯.

1.3　主要仪器

旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司)，循环水多用真空泵、水浴锅(郑州长城科工贸公司)，高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，精密天平(梅特勒-托利多仪器公司)，全自动酶标仪(Thermo公司).

2　方法

2.1　野西瓜醇提物制备

野西瓜经过干燥后打碎成粉状，称取适量，放入圆底烧瓶中加入足量95%乙醇进行提取，回流提取3次，抽滤，合并滤液在旋转蒸发仪上以低温 (45 ℃) 旋转蒸干，制得野西瓜浸膏. 实验前用蒸馏水溶解至所需浓度.

2.2　热板法实验

按文献[4]方法进行热板实验，选取痛阈值在5～30 s内的SPF级小鼠40只，分别为空白组、3组剂量组(50、100、200 mg/kg)和吗啡阳性对照组. 阳性对照组给予10 mg/kg的吗啡，空白组给予等体积蒸馏水，给药体积按5 mL/kg计算. 腹腔给药40 min后再次测定小鼠的痛阈值. 计算最大镇痛效应，公式为：MPE % =(给药后痛阈时间-基础痛阈时间)/(60-基础痛阈时间)×100%.

2.3　冰醋酸所致小鼠扭体反应实验

取小鼠40只，雌雄各半，同2.2方法分为5组，阳性对照组给予200 mg/kg的阿司匹林溶液，空白组给予等体积蒸馏水，给药体积按5 mL/kg计算. 给药40 min后各组腹腔注射0.6%的冰醋酸溶液，给药剂量10 mL/kg. 注射完毕，立即记录小鼠20 min内扭体反应的次数，腹部肌肉收缩同时后腿伸展记为一次扭体.

2.4　福尔马林所致小鼠疼痛实验

取小鼠40只，雌雄各半，同2.2方法分为5组. 阳性对照组给予200 mg/kg的阿司匹林溶液，空白组给予等体积蒸馏水，给药体积按5 mL/kg计算. 各组给药1 h后，小鼠右后足底注射5%福尔马林 (10 μL/只). 以秒表记录小鼠注射后 0～5 min和 15～30 min累计舔后足的时间，作为1相和2相疼痛强度的指示信号. 1相 (0～5 min) 和2相(15～30) min分别代表小鼠的神经性和炎症性疼痛反应[5-7].

2.5　前列腺素E2含量测定实验

福尔马林实验结束后，脱颈椎处死小鼠，在踝关节以上0.5 cm处剪下致炎肿胀后足，称取左右两足重量，计算差值. 然后将剪下的后足绞碎，5 mL生理盐水浸泡1 h，3000 r/min离心5 min，吸取上清液0.1 mL，加入0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液2 mL，50 ℃异构化20 min，用甲醇稀释至20 mL，在波长278 nm处测吸光度，以每克炎性组织相当的OD值表示前列腺素E2(PGE2)的含量.

2.6　NO浓度测定实验

将密度为2×106个/mL的小鼠腹腔巨噬细胞的悬液均匀接种于96孔板中，每孔100 μL，待细胞贴壁后(约2 h)，加入不同浓度野西瓜醇提物 (50、100、200 Mg/mL) 和LPS 1 μg/mL各100 μL，并设LPS模型组和空白对照组，每个浓度设6个复孔，37 ℃预处理48 h后，取培养液上清按50 μL/孔加入96孔板中，室温下，再在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ，以含10%小牛血清的DMEM加显色剂为空白对照组，标准品为NaNO2，用含10%小牛血清的DMEM稀释，浓度设定为1、2、5、10、20、40、60、100 μ mol/L，以酶标仪测定各孔在540 nm处的吸光度值.根据标准品各浓度所得OD值拟合NO反应的标准曲线，所得回归方程为：y= 0.0234x+0.0452，y为NO浓度 (μmol/L)，x为标准品吸光度值OD540，R= 0.9993，线性关系良好. 按标准曲线回归方程求出待测样本NO浓度.

2.7　统计学处理

实验结果用x±s表示，采用SPSS11.5软件进行统计学结果分析，采用ANOVA方法进行组间差异比较.

3　结果

3.1　野西瓜醇提物对小鼠基础痛阈值的影响

从实验结果可以看出(图1)，3个剂量组的野西瓜均有较高的最大镇痛效应，镇痛效果明显，与空白组相比有显著性差异，50～200 mg/kg的野西瓜引起剂量依赖性镇痛效应. 同时，3个剂量组与阳性对照组相比，也均具有显著性差异, 空白组没有表现出明显镇痛效应.

*p< 0.05，**p < 0.01，与空白组相比；# p<0.05,## p<0.01 ，与阳性对照组相比图1　野西瓜对小鼠热板实验的镇痛作用Fig.1　Analgesic effect of Capparis spinosa L. on hot plate test in mice

3.2　野西瓜醇提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

扭体实验数据显示(表1)，3个剂量组的野西瓜均可不同程度抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭体反应.低剂量组野西瓜(50 mg/kg)抑制程度较低,但依然能够显著抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭体反应(p<0.05)，200 mg/kg和100 mg/kg剂量组的镇痛效应较其他给药组更加显著.

表1 野西瓜对醋酸所致扭体反应作用Tab. 1　Effect of Capparis spinosa L. on writhing induced by ethylic acid

*p<0.05，**p<0.01，与对照组比较；#p<0.05，与阳性对照组比较

3.3　野西瓜醇提物对福尔马林致痛小鼠作用及前列腺素E2释放的影响

野西瓜50～200 mg/kg 对福尔马林所致小鼠双相疼痛(神经性疼痛和炎症性疼痛)反应均呈剂量依赖性的抑制作用(表2). 其对2相炎症性疼痛的镇痛效果比1相更加明显. 同阳性对照组阿司匹林组相比，200 mg/kg剂量组的野西瓜可以降低左右足的重量差，表明野西瓜具有一定抗炎作用.低剂量组50 mg/kg和100 m/kg对1相疼痛没有明显的抑制作用(p>0.05)，但对2相疼痛有明显的抑制作用.

表2　野西瓜对小鼠注射福尔马林后1相和2相的镇痛作用

*p<0.05，**p<0.01；与对照组比较

##p<0.01，与模型组比较图2　野西瓜对小鼠注射福尔马林后足PGE2释放的抑制作用 Fig.2　Inhibitory effect of Capparis spinosa L. on the release of PGE2 in mice after formalin injection

图2 显示，与空白对照组相比，注射福尔马林组的小鼠后爪中PGE2含量明显增加.阿司匹林 阳性对照组及剂量组50～200 mg/kg均能抑制PGE2释放，表明野西瓜的抗炎作用是通过抑制环氧化酶-2(COX-2)的活性实现.

3.4　野西瓜醇提物对脂多糖诱导细胞NO释放的影响

由图3可见，1 μg/mL的LPS作用小鼠腹腔巨噬细胞48 h后，能引起细胞NO分泌增加(p <0.01)，100、200 μg/mL浓度的野西瓜均能抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放(p<0.01).

**p<0.01，与对照组比较；## p<0.01，与LPS组比较图3　野西瓜对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的影响 Tab.3　Effect of Capparis spinosa L. on NO release induction by LPS in RAW264.7

4　讨论

从热板实验、冰醋酸扭体实验以及福尔马林致痛实验中观察到，小鼠给药后痛阈时间较基础痛阈时间显著延长，扭体次数明显下降. 福尔马林致痛实验给药组中1相和2相小鼠舔后足的时间均较空白对照组明显减少，表明野西瓜对中枢及外周性的疼痛都具有良好的镇痛效果.

PGE2是前列腺素(PG)的一种，当机体细胞受到损伤或机械、物理或化学刺激时，可经过一系列酶促反应生成PGE2. COX是PGE2合成过程中重要的限速酶，人体内有两种不同的COX同工酶，即COX-1和COX-2. 普遍认为，COX-1是体内正常的生理性酶，能够调节组织器官内生理性的PG；而COX-2则是一种经过诱导后产生的诱导或病理性酶，可在炎症部位催化炎性的PG合成并能诱发炎症反应. Siegle等[8]发现在各类关节炎中，COX-2有不同程度的增高，而COX-1则无明显变化，说明主要是COX-2促使PG合成增加，进而引起了炎症反应的放大和增强. 注射福尔马林组的小鼠后爪中PGE2含量明显增加,而3个剂量组的野西瓜能有效抑制PGE2释放，说明野西瓜是通过抑制环氧化酶-2(COX-2)的活性实现.

在各种炎性疾病病理过程中，NO起着重要的作用.适量的NO有助于减轻炎性反应、杀灭病原微生物，但巨噬细胞在炎性或免疫性刺激下能够产生大量的NO，这些NO能够与超氧阴离子等氧自由基发生反应，进而增加其对组织细胞产生的细胞毒效应. Griess法结果显示野西瓜能够抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞内NO的产生，使NO不能在细胞内过度释放，从而减轻细胞毒作用.

上述实验结果进一步明确野西瓜具有良好的抗炎镇痛作用，为其开发成为抗炎镇痛类新药提供了实验依据.

[1]陈锐.柏子养心丸临床应用解析[J].中国社区医师，2001，(4):15.

[2]何承辉，田红林，康小龙. 刺山柑总生物碱对系统性硬皮病小鼠血管内皮生长因子和内皮素-1 及可溶性血管细胞粘附分子-1 的影响[J]. 医药导报,2017,36(12):1367-1370.

[3]中国科学院新疆生物土壤沙漠研究所. 新疆药用植物志[M].乌鲁木齐：新疆人民出版社，1981.

[4]徐叔云，卞如廉，陈修. 药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1994：70-72.

[5]Potes C S, Neto L, Castro-Lopes J M. Inhibition of pain behavior by GABABreceptors in the thalamic ventrobasal complex: Effect on normal rats subjected to the formalin test of nociception [J]. Brain Research, 2006,1115(1):37-47.

[6]Sawynok J,Reid A.Antinociception by tricyclic antide-pressants in the rat formalin test: differential effects on different behaviors following systemic and spinal administration[J].Pain, 2001,93(1):51-59.

[7]Xu Y, Ku B, Geng X. Analgesic effects of tetrodotoxin combined with acetylsalicylic acid on acetic acid-induced abdominal constriction and formalin test in mice [J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2005,14(3):186-192.

[8]Siegle I, Klein T, Backman J T et al. Expression of cyclooxygenase1 and cyclooxygenase2 inhuman synovial tissue: differential elevation of cyclooxygenase 2 in inflammatory joint diseases [J]. Arthritis Rheum,1998,41(1): 122-129.