喂养不耐受早产儿肠道菌群的研究

陈静，方拴锋

郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院(郑州儿童医院) 儿童保健科，河南 郑州 450000

由于早产儿消化系统尚未发育完全，导致胃肠调节能力低下和消化液分泌不足等诸多问题。因此在喂养过程中容易出现早产儿腹胀、呕吐、胃潴留等多种症状。当这些症状出现进行性加重并伴有喂养障碍时，将会导致新生儿喂养不耐受(feeding intolerance，FI)，严重时可导致新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)，该疾病是引起新生儿高病死率的主要原因[1]。研究表明，肠道中早期微生物的组成影响了新生儿的诸多生理功能，包括免疫防御、血管再生、感觉-运动功能、屏障功能、肠道营养和激素分泌等[2]。因此，早产儿FI发病可能与异常菌群在肠道定植有着密切的关系[3]。本研究通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析和比较FI早产儿和早产儿肠道微生物的差异，从微生态学的角度分析早产儿FI发病的可能机制，为临床医生认识早产儿FI以及为治疗早产儿FI提供新思路。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2016年3月至2017年3月在我院儿科新生儿病房收治的30例FI早产儿为研究对象。入选标准：(1)孕周32～37周，出生体重<2 500 g，经剖宫产娩出，以配方奶喂养，出生时无脐绕颈、无窒息以及羊水污染史，生后24 h内收住新生儿科；(2)FI诊断标准：早产儿无法消化肠内食物，鼻饲下胃内残余量超过喂入量的50%，伴有腹胀、呕吐或两者兼有[3]；(3)母亲健康状况：1为健康、0为不健康。排除标准：有消化系统先天畸形者、NEC、脓毒症及抗生素、益生菌使用者。对照组选取同时间段与FI组的胎龄、纳入分组时的日龄、体重等相匹配未发生FI的10例早产儿。采集出现FI时和同时间段对照组的早产儿的粪便标本，用无菌EP管收集，干冰送至实验室，-80℃保存备用。

1.2试剂及仪器 使用天根细菌总DNA提取试剂盒(天根生化科技，北京)提取粪便样本中总细菌DNA。Real-time PCR检测目的基因的表达，引物序列见表1。引物和SYBR premix Ex TaqTM购自宝生物(大连，中国)，实时荧光PCR扩增仪为Bio-Rad CFX96 PCR扩增仪(Bio-Rad公司)。

1.3标准曲线的制作 取健康婴儿粪便基因组DNA，用细菌引物进行特异性扩增，将扩增产物进行纯化，测定纯化产物的吸光度值和浓度，换算为各样本标准品1 μL的拷贝数用于制作标准曲线。

1.4荧光实时定量PCR检测 96孔反应板加入总体积为25 μL PCR反应液。按下列体系加样：DNA模板2 μL，PCR上、下游引物各1 μL，SYBR 12.5 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应条件如下：(1)大肠埃希菌：预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，循环数40。(2)肺炎克雷伯菌和粪肠球菌：分别预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火59℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，循环数40。(3)双歧杆菌和乳杆菌：分别预变性95℃ 10 min；变性95℃ 15 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，循环数40。

表1 细菌特异性引物序列

1.5数据分析

1.5.1研究对象临床特征分析 使用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1.5.2荧光实时定量PCR分析 利用2△△Ct方法计算目的基因与内参基因的相对表达比值，依次反映FI组与对照组目的基因相对表达情况。具体计算方法如下：求出每个样品目的基因和内参基因的3个复孔Ct值的平均值；△Ct=目的基因-内参基因；△△Ct=FI组△Ct-对照组△Ct；目的基因相对表达量=2△△Ct。设3个复孔，以确定扩增的重复性好，检验结果是否可靠，见图1。

注：A～E分别为大肠埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacteria)的扩增曲线。

图1肠道细菌荧光实时定量PCR重复性检验

2 结 果

2.1临床特征 表2显示不同组间的一般临床特征。在开始喂养的1周内，FI组早产儿大多出现以腹胀、呕吐为主要临床表现的症状，呕吐物均为未消化奶瓣，每个早产儿呕吐次数≥3次/d。两组早产儿胎龄、出生体重和性别比较差异无统计学意义。

2.2目的基因相对表达量比较 结果显示：FI组早产儿肠道大肠埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)相对表达水平明显高于对照组(图2A-B)，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacteria)表达明显低于对照组(图3C-E)。

表2 两组研究对象临床特征

注：A～E分别为对照组与FI组早产儿肠道中肠道大肠埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacteria)的表达情况，同对照组比较，aP<0.01。

图2FI组和对照组早产儿肠道细菌的相对表达量

3 讨 论

3.1结果分析 在肠道复杂的微生态系统中，微生物群落通过细菌与宿主、细菌与细菌间形成相互制约、相互依赖的肠道微生态系统，并发挥着机体防御、营养及免疫调节等诸多功能[2,4]。本研究结果显示，与相同出生条件的早产儿相比，FI组早产儿肠道中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌数量差异有统计学意义。其中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等有害菌的增加，粪肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌的减少可能导致肠道定植抗力降低，消弱了早产儿机体抵抗疾病的能力。

大肠埃希菌作为人体胃肠道典型的共生菌，在新生儿生后数小时便出现在胃肠道中，通过消耗肠腔中的氧气，为多种专性厌氧菌的定植创造适宜条件。当机体内微生态环境失衡后，大肠埃希菌亦可通过与人体细胞发生特异粘附、进而定居繁殖和产生肠毒素发挥致病作用。在本研究当中，Real-time PCR结果显示了早产儿粪便样本中FI组的大肠埃希菌相对表达量明显高于对照组，提示了早产儿胃肠道中异常增加的大肠埃希菌可能是FI的致病危险因素之一。其具体的原因和机制尚不清楚，还需进一步的研究。

肺炎克雷伯菌作为人类消化道条件致病菌之一，当机体抵抗力低下时，极易在肠道中定植并繁殖，进而导致肠炎[5]。由于早产儿免疫系统尚未发育完全，经常使用侵入性医疗操作或使用抗生素治疗，极易引发肺炎克雷伯菌感染[6]。Real-time PCR结果显示，早产儿粪便样本中FI组的肺炎克雷伯菌明显高于对照组早产儿。因此，肺炎克雷伯菌可能参与了早产儿FI的发病过程。

肠球菌属的粪肠球菌，可通过自身代谢产物与其他肠道菌群一起调整机体微生态的动态平衡[7]。国内相关研究已经报道了粪肠球菌可通过与肠上皮细胞相互作用，减轻宿主的炎症反应，为肠道疾病提供保护作用[8]。在本研究当中，Real-time PCR结果显示FI早产儿粪便样本中粪肠球菌数量低于对照组早产儿，其具体作用和机制还需要进一步研究。

乳杆菌作为肠道益生菌，可通过产生乳酸、细菌素以及过氧化氢等抗菌物质抑制肠道有害菌的生长，进而起到保护肠道的作用[9]。研究证实，早产儿肠道乳杆菌定植时间要比足月新生儿晚[10]，而且数量也明显偏低[11]。国内外多项研究表明，乳杆菌等益生菌对早产儿肠道各功能的发育、发展及成熟起到了重要的保护作用[12]。本研究结果显示，FI早产儿粪便样本中乳杆菌数量低于健康早产儿。提示了肠道乳杆菌有益菌的减少减弱了益生菌的保护性作用，极易遭受致病细菌的攻击，使得早产儿FI发生的几率大大提高。

同样作为肠道益生菌的双歧杆菌在肠道免疫功能上也起到了举足轻重的作用。新生儿出生后5～6 h肠道内就有双歧杆菌定植，1～2周后成为肠道的优势种群。双歧杆菌与新生儿肠道功能、免疫功能和营养代谢密切相关，是保证儿童正常生长发育所必需[13]。本研究结果显示，FI早产儿粪便样本中双歧杆菌数量要明显低于健康早产儿。提示了双歧杆菌可能同粪肠球菌和乳杆菌一样是FI早产儿的保护因素。

3.2同类研究的比较以及不足之处 与其他研究相比，本研究利用Realt-ime PCR技术检测早产儿粪便样本中的菌群变化。发现早产儿粪便样本中FI组的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌相对表达量明显高于对照组，然而粪肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌却明显低于对照组。相比于其他同类型的研究，利用Real-time PCR能快速准确的鉴定出FI早产儿胃肠道菌群的变化，而FI和这5种细菌之间的因果关系有待于深入研究。考虑到机体微生态是一个复杂的情况，该研究仅选择了具有代表性的菌类进行研究，其他的菌类尚未涉及。因此，在以后的研究中可扩大研究的菌群数量，为以后临床应用提供理论和技术基础。

3.3研究的意义 除了由于早产儿自身肠胃功能不成熟所导致FI的原因之外，胃肠道微生态失衡也是导致早产儿FI的诱因之一。本研究的结果揭示了早产儿FI与肠道菌群失衡的关系，为临床上认识的发生机制和治疗提供新的思路。

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