检测用抗体标准样品的研究现状和展望

乔彩霞， 王 强， 刘艳华， 高志强， 周 建， 边 勇， 刘 巍

(北京出入境检验检疫局， 北京 朝阳 100026)

血清学检测方法是利用抗原抗体在体外的免疫反应，实现疫病感染检测和免疫效果评估，已在人类和动物疫病的监测和诊断中得到了普遍使用。常规的血清学方法主要包括有琼脂免疫扩散试验、血凝抑制试验、补体结合试验、病毒中和试验和酶联免疫吸附试验等。 抗体标准样品是用于血清学检测方法质量控制和评价的重要材料，对于保证抗体检测结果的准确性、一致性和可比性，实现检测方法的标准化应用具有重要意义。 国内外已经研制了一些抗体标准样品，为抗体检测方法质量的提升提供了保障。 同时，世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)也均发布了生物类和抗体标准样品的研制指南，用于指导检测用抗体标准样品的研制工作。 本文将介绍国内外抗体标准样品研制规范和研究现状，并分析其应用前景，以期为我国检测用抗体标准样品的制备和应用提供参考。

1 抗体标准样品简介

标准样品，又称标准物质(Reference material)是指具有一种或多种规定特性足够均匀且稳定的材料，已被确定其符合测量过程的预期用途。 有证标准样品(Certified reference material)是指经相关部门审批后，附有证书提供规定特性值及其不确定度的标准样品。 其特性值可以是定量的或是定性的，包括物理、化学或生物特性量的值。 抗体标准样品是生物类标准样品的一种，用于血清学检测方法和试剂的质量控制，多采用血清研制，也有部分采用单克隆抗体或脱脂牛奶等材料制备。 抗体标准样品通常用血清学检测反应来描述其特性值即抗体活性。

2 抗体标准样品的研制

2.1 依据规范 世界卫生组织(WHO)早在1978年首次出版了制备和建立生物类标准样品的指南，并在1986、1990、2004 年进行改版[1]，指南较为全面的规定了国际生物类标准样品研制的技术要求，内容涉及样品制备、效能检验和包装分发、保存等环节，成为生物类标准样品研制的重要参考。 世界动物卫生组织(OIE)专门发布了抗体标准样品的研制指南[2]，内容包括候选血清样品的来源、采集、检测、保存等，其关键技术环节是抗体标准样品的制备和特性检测。 目前，我国尚缺乏针对抗体标准样品的研制规范，研制多是借鉴国际组织的做法和经验。

2.2 抗体标准样品的候选材料 抗体标准样品的候选材料应与被检测样品接近，并纯净、安全无污染。 因此，多数抗体标准样品均由血清制备，要求候选血清无溶血和过量血脂，并经过2 种以上国际公认的方法检验确认，检测特性包括特异性和抗体反应活性的测定，血清中不应含有与目标病原可能存在交叉反应的抗体。 条件容许的情况下，应选用无特定病原体或SPF 动物，通过实验感染或疫苗免疫制备血清，血清样品可以来自单个动物或来自许多动物的样本的混合。 特殊情况下，当免疫或感染制备不可行时，血清也可采自自然感染动物。 血清采集后，还需消毒处理，并检测证实无感染性病原存在。 牛血清应该来自无疯牛病国家的动物。

2.3 抗体标准样品的种类 血清学检测技术可分为定性检测和抗体滴度测定的定量检测两种类型，前者如免疫琼脂扩散试验、免疫荧光试验等，检测结果以阴、阳性体现。 后者如病毒中和试验、血凝试验，补体结合试验，检测结果以抗体滴度加以标识。 因此，对于大多数血清学方法常用的标准样品包括强阳性、弱阳性和阴性样品3 种，其中弱阳性样品对于确定检测方法的敏感性最为关键。 除此之外，抗体标准样品还包括最低检出量参考品、精密性参考品及定量标准品等，这些样品是全面评价诊断试剂质量，控制检测灵敏度、精密度及定量的重要参考[1-3]。

2.3.1 强阳性标准样品 对于如补体结合、病毒中和或间接ELISA 等有着典型的S 型剂量-反应曲线检测技术，强阳性标准样品的反应活性检测结果应处于曲线平台期下的线性增长期；对于其他类型的检测技术，其检测结果应接近检测范围的上限，如免疫扩散试验出现清晰沉淀线或竞争/阻断ELISA 检测为100%的阻断率。

2.3.2 弱阳性标准样品 对于有典型S 型剂量-反应曲线的检测方法，弱阳性标准样品的反应活性检测结果应处于S 型曲线阴阳性临界值稍上的线性增长期内，且结果明确不能存在争议。 对于其他类型的检测方法，弱阳性标准样品的检测结果应接近检测范围的下限，如在免疫扩散试验中，弱阳性样品的反应线应该浅而明确，在竞争/阻断类检测试验中，阴阳性样品结果的转折较大，弱阳性标准样品的制备难度较大，但与有典型S 型剂量-反应曲线的检测技术的原则一样，弱阳性样品用标准程序检测时结果应明确，且位于阳性/阴性临界值之上较小的范围内。

2.3.3 阴性标准样品 阴性标准样品用标准程序检测时结果应始终低于阳性/阴性临界值，且结果明确不存在争议。

2.3.4 其他样品 最低检出量参考品、精密性标准品及定量标准品等，也是抗体标准样品的重要组成。 最低检出量标准样品由系列稀释阳性样品组成，用来控制试剂的灵敏度，即试剂所能检出的样品中阳性物质的最低限度。 精密性标准品由一份经过确认的中等阳性样品组成，用来控制试剂的精密度。 定量标准品应由一定数量经确证的阳性样品组成，采用相应的国际定量标准品对样品进行标化，设置量值及线性标准，用于控制定量试剂的准确性。

2.4 抗体标准样品的制备、保存 阳性标准样品应尽可能直接选择含有相应抗体滴度的候选血清制备，但多数情况下，需要用阴性血清将阳性血清进行稀释，从而获得含有预期抗体滴度的阳性样品，而弱阳性样品也就可以通过稀释同一批的强阳性样品而制备。 所有样品材料在制备期间应冷冻或冷藏保存，避免反复冻融。 为了保证稳定性，样品在灭活病原后应冻干，同时配带无菌稀释液用于样品的复溶。 长期储存样品时应尽可能选择密封的玻璃安瓿瓶保存，这比带橡胶帽的西林瓶有利于样品的稳定。 即便常温下短时间内样品不会降解(如运输期间)，冻干样品仍应储存在4 ℃。 一个批次的标准样品，采集的候选材料应至少满足5 年的使用，而冻干的标准样品也应至少供应两年的测试(500 次测试)，具体应根据预计使用的频次和数量加以确定。 所制备的标准样品或者冻干保存，或者储存于-70 ℃条件，并保存有完整的每一批次的质量控制数据。 包装一般为0.5 ～1 mL/瓶或者安瓿。

2.5 标准样品的检验 制备好的标准样品需进行物理性状、无菌、抗体活性、均匀性和稳定性等一系列检验，以保证标准样品的质量。 如标准样品为冻干样品，应疏松多孔、颜色均匀，表面无明显的断裂现象，加入稀释液后能立即溶解。 冷冻干燥过程有时会影响抗体的反应活性，因此应采用国际公认的血清学方法，评价冻干前后活性的变化及样品的均匀性和稳定性。 OIE 明确指定使用《陆生动物诊断试验和疫苗手册》国际贸易指定的检测方法，测定抗体标准样品的反应活性。 根据国际惯例，目前抗血清标准样品不设“有效期”，由研制单位对样品稳定性定期进行监测。

2.6 抗体标准样品的定值 标准样品在研制后，要求对样品完成定值。 定值是对标准样品特性量进行赋值的过程，是其作为一种实物标准能复现、保存和传递量值的保证。 标准样品的定值方式有4种：用高准确度的绝对或权威测量方法定值；用两种以上不同原理的已知准确度的方法定值；多个实验室协作定值；以及与已有的标准样品比对定值。由于生物类标准样品不能应用物理和/或化学的方法进行准确量值描述，抗体标准样品的特性值被赋值为抗体强阳性、弱阳性或阴性，而其具体的量值显示往往和具体使用的检测方法密切相关。 对于不能精确定量的标准样品，通常要求联合6 ～8 家以上权威实验室采用国际公认的方法协作定值，对结果统计分析确定阴、阳性，并在所附的数据清单中说明其抗体反应活性。 国际抗体标准样品赋值的典型例子如WHO 提供的布鲁菌抗体血清(冻干)样品其量值表示为1 000 IU 凝集活性和补体活性/安瓿，国际单位(IU)定义为在每0.09552 mg 国际标准样品含有的抗体活性。

2.7 标签和资料清单 标准样品需加贴标签，标签应至少包含以下信息：名称、阴阳性、制备实验室、重溶条件、储存条件等，空间不足可使用缩写，部分信息也可在资料清单内体现。 资料清单是标准样品使用的重要说明材料，内容应包括：样品供体动物、抗体来源(感染或免疫)和病原的详细信息；感染或免疫的程序；筛选方法、反应活性、异源抗体、安全性等检测结果；灭菌方法；批号、生产日期、处理和储存条件等常规信息；制备实验室的完整联系地址、传真、电子邮件等。

3 研究现状

3.1 国际研究现状 目前，国际医用/兽用生物标准样品主要由WHO、OIE 和联合国粮农组织(FAO)3 大国际组织进行规范和推广应用。 WHO 目前批准的生物类标准样品有300 余种，其中用于动物疫病诊断的抗体标准样品仅有10 种[4]，主要由伦敦的国家生物标准样品与检定所(NIBSC)和英国国家兽医实验室(VLA)提供，所提供的抗体标准样品均为冻干样品，并附有国际单位(详细见表1)。FAO 则主要通过技术援助系统帮助成员国建立和实施生物制品的质量控制系统，也承担一些对外发放标准样品的职能，自身并不承担验证和提供标准样品的职责。 OIE 是审核和发放兽用标准样品的重要组织，截至目前，共批准了23 种国际标准血清[5]，针对了19 种动物疫病，涉及13 种类别的检测方法(详细见表2)。 这些抗体标准样品均为国际一级标准样品，通常用于国际、国家和其他实验室检测技术的校准，国际贸易中检测结果的互认，并作为二级标准样品生产的依据，从表1 和表2 可以看出，美国、英国和法国等发达国家都参与了抗体国际标准样品的研制工作，而我国明显滞后。

3.2 国内研究现状 在我国，有证国家标准样品由全国标准样品技术委员会实施、监督和管理，经过国家标准化管理委员会评审、审批和发布，主要是为了配合国际和国内文字标准的使用，实现检测方法的质量控制和标准化应用。 我国生物类标准样品的起步较晚，开展了一些抗体标准样品的研究工作，但获得的有证标准物质相对较少。 目前，医用/兽用生物标准样品主要由中国药品生物制品检定所和中国兽医药品监察所保管和分发，现可提供乙型肝炎，艾滋病等16 种人类传染病抗体血清标准样品(详见国家标准样品资源共享平台(http：/ /www. ncrm. org. cn)，均可溯源到国际一级标准样品。 动物疫病检测领域，可提供布鲁菌病、猪瘟等24 种动物传染病抗体血清标准样品(见表3，来源于国家兽药基础信息查询系统标准样品数据库http：/ /sysjk. ivdc. org. cn：8081/cx/)。 但现有抗体血清标准样品的研制不够规范，未能达到国际和国家标准样品的技术要求[5-6]。

4 抗体标准样品研制中存在的主要问题

经过几十年的发展，国内外抗体标准样品的研制、认可和发布已得到了一定的发展，但在种类和赋值方面，抗体标准样品尚存在诸多问题，亟待解决[7-9]。

4.1 样品数量少，不能满足疫病检测的需要 目前动物疫病抗体国际标准样品主要由OIE 提供，覆盖的病种仅有19 种动物疫病[5]，目前针对禽流感、非洲猪瘟等严重危害养殖业和公共卫生的动物疫病，尚没有相应的抗体标准样品提供。 在我国，虽然标准样品针对的动物疫病种类达到了23 种，但研制与OIE 指南不太相符，未能同时研制一种疫病的强阳性、弱阳性和阴性样品，不足以用于检测技术的标准化；其次，标准样品信息不够完整，缺乏研制单位、样品状态、适用范围等关键信息不足以满足检测技术的标准化。 随着经济全球化进程加快，实现动物疫病检测技术的标准化和国际互认已经成为影响动物及其产品贸易的重要因素，目前进出境动物检疫中涉及的疫病已多达200 种，因此，针对重要的动物疫病研制抗体标准样品急需丰富完善。

表1 WHO(NIBSC)提供的动物疫病抗体血清标准样品

表2 OIE 批准的动物疫病抗体国际标准血清样品

表3 我国现有动物疫病抗体标准样品

4.2 量值标定难，制约检测结果可比性 作为标准样品，要有明确的量值，生物类标准样品的定值和不确定度分析，是目前研究的热点和难点。 目前仅有有限的几种动物疫病，国际上有公认的抗体反应活性单位，大多数动物疫病目前尚缺乏用于确定其反应活性单位的体系。 WHO 依据抗体标准样品生物学活性或者免疫反应活性作为其衡量单位，即国际单位(international units， IUs)。 国际单位的使用，便于检测技术的国际化，提供了衡量免疫或感染状态的国际认可的重要基础。 目前，我国仅有布鲁菌、鸡毒支原体和鸡白痢、鸡伤寒标记了国际单位。 WHO 和OIE 在标准样品的定值中均尚未引入不确定度，ISO 标准样品工作导则中明确定性标准样品的不确定度可用概率表示[10，11]，抗体样品的特性值如何表示还有待结合实际检测工作进行研究和探讨。

4.3 样品种类单一，阻碍检测方法和试剂的全面评价 阳性、阴性抗体标准品是传染病体外检测试剂最为常用的两种样品，这也是我国和国际上目前主要研制的抗体标准样品。 但要实现传染病体外检测试剂的精确定量检测，全面评价诊断试剂的质量，还需要研制精密性标准品、最低检出量参考品及定量标准样品，从而更为准确的评价检测技术的特异性、灵敏度、精密度等。

5 应用前景展望和结语

2013 年，我国国务院印发了《计量发展规划(2013 -2020 年)》，其中提出加强标准样品研究和研制的工作任务，包括开展基础前沿标准样品研究，扩大国家标准样品覆盖面，填补国家标准样品体系的缺项和不足，满足食品安全、生物、环保等领域和新兴产业检测技术配套和支撑需求。 2017 年，我国发布《全国动植物保护能力提升工程建设规划》(2017 -2025 年)，明确要提高我国兽用标准物质的研制质量，促进兽医生物制品、诊断试剂和化学药品质量提升。

动物疫病标准样品是动物疫病诊断和防控的必要基础，抗体标准样品可用于血清学检测方法的建立、验证和评价检测试剂的质量、实验室能力验证和人员素质的考核，也是与国外实验室开展技术交流的重要媒介。 完善和规范抗体标准样品的研制、认可和公布，不仅可提高抗体标准样品研制的技术水平，也有助于检测结果的准确可靠和国际互认。