食源性单增李斯特菌的分离鉴定及药物敏感试验

李红欢， 陈 朔， 康立超， 马 勋， 钱凌霄， 张奇文， 杜冬冬

(1.石河子大学动物科技学院， 新疆 石河子 832003 ；2.新疆农垦科学院分析测试中心， 新疆 石河子 832003)

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，以下简称：单增李斯特菌)，是细胞内寄生的革兰阳性短杆菌，一种重要的食源性人兽共患病原菌，该菌在4 ℃环境中仍可生长繁殖，通过污染奶及奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等食物导致人群感染，是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一[1]。该菌致病性强、致死率高达30%[2]，能引起人和动物李斯特菌病，如人类的脑膜炎、败血症、肺炎、热性胃肠炎、流产等疾病[3]，新生儿、孕妇、老年人和免疫功能低下者更易感染发病[4]， 由于感染此菌的高致死率，我国对食源性单增李斯特菌的检测十分重视，作为国家食品污染物和有害因素风险监测必检微生物指标之一[5]。

近年来因食品污染本菌而引起的食物中毒病例频繁发生，使李斯特菌病作为一种重要的食源性传染病在世界范围内对食品安全及人类健康造成极大的危害[6]。 欧盟报道，加拿大2009 年共发生了1 645 例由单增李斯特菌引起的食物中毒病例，比2008 年增加了19.1%[7]。 李斯特菌生命力强，能在低温环境甚至冰箱内存活，主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一，会造成二至三成的感染者死亡。 2015 年，美国出现蓝钟( Blue Bell) 冰淇淋事件， 3 人感染死亡。 我国2000 -2009 年文献检索出单增李斯特菌病例92 例[8]。 国内外报道从多种食品中分离到李斯特菌或食品污染李斯特菌而引起的食物中毒暴发事例[9]，为此单增李斯特菌成为新的重要的食源性疾病病原菌，已引起了食品卫生管理部门的广泛关注，许多国家均加强了对该菌的检测及研究工作。

李斯特菌病相对罕见，然而一旦发生，病死率很高，因而准确及时地早期诊断及合理的抗生素治疗显得尤为重要[10]。 随着抗生素在临床和畜牧业中的广泛使用与滥用，单增李斯特菌面临严重的抗生素选择压力，已有报道[11]指出，我国出现对二线药物耐药的菌株，给临床用药的选择带来了很大的挑战。 为了解新疆生产建设兵团食源性单增李斯特菌分离株的耐药性，本研究对食源性单增李斯特菌进行耐药性的测定，为有效控制细菌耐药、科学评价单增李斯特菌分离株致病意义提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2014 年新疆生产建设兵团8 个师，常规送检的外卖盒饭158 份，冷冻鱼糜制品121份、调理肉制品90 份，学生餐270 份，生食肉类50份，凉拌菜21 份，冷冻饮品10 份，鸡2 份，奶酪3份，糕点2 份等10 类食品共计727 份，用于检测单增李斯特菌。

1.2 标准菌株 单增李斯特菌标准菌株标号为27708；药敏质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.3 培养基和试剂 李氏增菌肉汤(LB1，LB2)，TSA-YE；PALCAM 琼脂，单增李斯特菌显色培养基CHROM agar，脑心浸液培养基(BHI)， 购自青岛高科园海博生物技术有限公司；青霉素、四环素、庆大霉素、环丙沙星等17 种抗生素药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4 方法

1.4.1 单增李斯特菌的分离培养与鉴定 参照《食品卫生微生物学检验》GB4789/T.30 -2010[12]并结合《全国食品污染物监测计划- 食源性致病菌》部分方法进行。

(1)增菌：无菌操作提取样品25 g(mL)加入到含有225 mL LB1 增菌液的均质袋中，在均质器上连续均质1 min ～2 min；或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均质杯中，8 000 r/min ～10 000 r/min 均质1 min ～2 min。 于30 ℃培养24 h，移取0.1 mL，转种于10 mL LB2 增菌液内，在30 ℃培养18 h ～24 h。

(2)分离及培养：取LB2 二次增菌液划线接种于PALCAM 或CHROM agar 琼脂平板上，在36 ℃培养24 h ～48 h。 再将上述显色平板上的可疑菌落接种TSA-YE 平板和兔血平板上，30 ℃生长24 h 后，观察菌落和溶血情况。

(3)鉴定：挑取可疑菌落进行革兰染色，显微镜下观察其形态和染色特性。 挑取可疑菌落进行GP鉴定卡鉴定。 鉴定试验用单核细胞增生性李斯特标准菌株做阳性对照。

1.4.2 药敏试验 药敏试验按WHO 推荐的K-B琼脂纸片扩散法[13]进行，培养基为BHI 琼脂固体培养基。 将培养至对数期的细菌取500 μL 用涂布器均匀涂抹于BHI 固体培养板上；待培养基表面菌液吸收后，无菌镊子夹取药敏片贴于培养基表面，药敏片间距不少于30 mm；37 ℃条件下培养24 h 后，游标卡尺测量抑菌圈直径并做记录。 药敏结果判定采用NCCLS(CLSI)《微生物药物敏感性试验执行标准》M100 -S20[14]。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定 分离获得24 株可疑细菌，菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。 在CHROM agar 上的小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈。 在TSA-YE 平板上30 ℃生长24 h 后，可形成半透明的圆形露滴状菌落。 兔血平板上呈现β溶血。 可疑菌落为革兰阳性的短杆菌，单个、两两平行或排列成“V”字型。 经VITEK2-compact 全自动微生物鉴定仪GP 卡鉴定为单增李斯特菌，鉴定符合率为99.9%。

2.2 食品中单增李斯特菌检出情况 727 份样品中检出单增李斯特菌24 株，总检出率为3.3%。 其中，调理肉制品检出率最高，为17.77%；其次是冷冻肉糜制品，检出率为4.95%；外卖盒饭中检出率为1.26%；学生餐、生食肉类、凉拌菜、冷冻饮品、鸡、奶酪、糕点等样品中未检出该菌(表1)。

2.3 药物敏感 24 株单增李斯特菌分离株的17种抗生素药敏试验显示：对青霉素和环丙沙星耐药率100%，对磷霉素、氨苄西林、丁胺卡那霉素、复方新斯诺明、四环素耐药率分别为54.17%、37.5%、20.83%、20.83%、16.66%。 大部分菌株对头孢唑林、头孢噻吩、亚胺培南、左氧氟沙星、诺氟沙星、强力霉素、万古霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素敏感。

表1 样品数量及单增李斯特菌检出率

除LM461，LM4786，LM3189，LM3195，LM5470，LM5474 等6 株菌只对青霉素和环丙沙星耐药外，其余菌株均表现多重耐药，多重耐药菌株占总分离株的75.0 %。 其 中 LM2935、 LM2956、 LM3197、LM5563、LM5573、 LM3103-1、LM6072 大和LM6072小等8 株菌出现3 重耐药，占总分离株的33.3%；LM502、LM2941、LM3251、LM4786 和LM5570 等5株菌出现4 重耐药，占总分离株的20.8%；LM472、LM2947、LM4788、LM5567 和LM502-2 等5 株菌出现5 重以上耐药，占总分离株的20.8%。

3 讨论

单增李斯特菌作为四大食源性致病菌之一，由于其感染病死率高、危害大，日益引起人们的重视。在国外，单增李斯特菌在RTE 食品中的污染率报道较多。 Inoue[15]等的研究表明日本零售食品单增李斯特菌污染率为5.4% ～25%，牛肉、猪肉、鸡肉单增李斯特菌的污染率分别为12.2%，20.6% 和37%。 Prazak[16]等研究发现卷心菜的单增李斯特菌污染率约为3%。 杨红菊[17]等在130 份畜禽产品样品中共检出致病菌46 株，其中单增李斯特菌的检出率为16.9%，且细分品种，猪肉中单增李斯特菌检出率最高。 龚云伟等[18]对市售26 份熟肉制品的分析结果显示，有26.9%的单增李斯特菌阳性。 古丽巴哈尔·托乎提[19]等在冷冻饮品中检出单增李斯特菌。 刘海霞[20]等在2010 -2016 年熟肉制品和餐饮食品中共检出单增李斯特菌85 株， 占所采样品的1.65%，采集的熟肉制品和餐饮食品中， 污染较为严重的分别为酱肉类和中式凉拌， 检出率分别为2.66%和2.67%。 沙拉麦提·吐尔逊太[21]对新疆乌鲁木齐食品单增李斯特菌检出率的18.5%。此次常规送检的727 件食品中共检出单增李斯特菌24 株，检出率为3.3%，检出率比较低。 在食品分布中以调理肉制品污染较为严重，阳性率达17.77%，说明单增李斯特菌在国内、外的不同地区、不同类型食品分布存在差异。 本次单增李斯特菌的污染状况虽然不是很严重，但也存在单增李斯特菌引起食源性疾病的潜在危险。

表2 24 株单增李斯特菌分离株对抗生素敏感性_________________________________

通常临床用于治疗李斯特菌病的一线药物主要是氨苄西林或青霉素，单独使用或与庆大霉素联合使用，而复方新诺明、万古霉素与庆大霉素联合红霉素及氟喳诺酮作为二线药物。 本研究中对分离到的24 株单增李斯特菌进行17 种抗生素的药物敏感性试验， 24 株单增李斯特菌对青霉素和环丙沙星耐药；部分菌株对磷霉素、氨苄西林、丁胺卡那霉素、复方新斯诺明、四环素、诺氟沙星和强力霉素耐药；耐药率分别为54.17%、37.5%、20.83%、20.83%、16.66%、8.33% 和8.33%。 且出现多重耐药菌株，其中有5 株菌出现5 重以上耐药，占总分离株的20.8%。 这与杨洋[22]对2005 年全国467 株食源性单增李斯特菌只对四环素和环丙沙星耐药，且没有多重耐药情况结果并不一致，但与赵悦[23]等对2007 -2009 年来自22 个地区9 类1 069 株食品源单增李斯特菌的耐药性分析，主要耐受四环素、强力霉素、红霉素、氯霉素和环丙沙星，耐药率6.92%，并出现了多重耐药株，以及闫韶飞[24]报道的2012 年635 株食品源单增李斯特菌主要耐受四环素、强力霉素、红霉素、氯霉素、环丙沙星，平均耐药率10.39%，出现多重耐药结果有相似之处，表明不同地区单增李斯特菌的耐药情况不同，并且随着时间的推移，耐药率逐渐提高，且出现多重耐药，提示临床用药前景堪忧。 虽然全球范围的单增李斯特菌临床用药耐药率还较低，但耐药谱很广，并出现了对青霉素和庆大霉素等一线用药的耐受。 应当加强对单增李斯特菌耐药性的监测，规范抗生素在临床和畜牧业的使用，以减缓耐药基因的转移和降低食源性耐药菌株的出现。

4 结论

本试验通过对727 份食品运用食品应用国标法进行细菌分离鉴定，检出单增李斯特菌24 株，并采用纸片扩散法对其进行了药物敏感试验，为有效控制细菌耐药、科学评价单增李斯特菌分离株致病意义提供科学依据。