不同铜源在蛋鸡腺胃吸收的药物代谢动力学和纳米氧化铜在腺胃肝脏的分布

崔 勇， 朱风华， 陈 甫， 李 玲， 巩青军， 张艳玲， 朱连勤

(1.青岛农业大学动物医学院， 山东 青岛 266109 ；2.青岛农业大学动物科技学院， 山东 青岛 266109 ；3.青岛农业大学生命科学学院， 山东 青岛 266109)

铜是家禽必需的微量元素之一，硫酸铜等铜源饲料添加剂生物利用率低，易随粪便排出造成铜污染。 因此，国内外学者以提高日粮铜吸收率、降低饲料添加量、减少环境污染为目标，不断探寻新的铜源化合物。 Peralta -Videa[1]等指出，当微小粒子进入纳米量级(1 nm ～100 nm)时，其本身具有量子尺寸效应、表面效应和量子隧道效应，导致纳米体系的光、热、电、磁等的物理性质出现许多新奇特性。 有研究表明，饲料中添加纳米氧化铜的生物吸收率与利用率高于硫酸铜和氧化铜，可减少饲料中Cu 添加量，并间接减少粪便中Cu 的排放量[2]。 本课题组前期研究表明，在饲料中添加高水平锌，雏鸡没有拮抗纳米氧化铜的吸收，没有呈现高锌对铜吸收利用的拮抗效应，这一定程度上说明了纳米氧化铜在机体的吸收转运机制可能异于常规铜源添加剂[3]。 进一步研究发现，在Caco-2 细胞模型上，纳米氧化铜的表观渗透系数、转运量和转运率高于硫酸铜和微米氧化铜，说明纳米氧化铜与硫酸铜、微米氧化铜的吸收机制不同，纳米氧化铜可能以铜离子和纳米粒子两种形式被机体吸收利用[4]。 本试验旨在研究硫酸铜、微米氧化铜及纳米氧化铜在鸡腺胃吸收药物代谢动力学和纳米氧化铜在鸡腺胃、肝脏的分布，从器官和细胞水平揭示纳米氧化铜在腺胃的吸收转运机制，为纳米氧化铜作为新型铜源添加剂在畜禽养殖上的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 JEM -2100F 型200 kV 场发射透射电子显微镜(JEOL，日本)；X -MaxN 80T 型能谱仪探头(Oxford，英国)；7700X 型电感耦合等离子体光学发射光谱仪(GE，美国)；EM-UC7 型超薄切片机(Leica，德国)；AR224CN 型电子天平(OHAUS，美国)；MQ -gard 型超纯水系统(MILLIPOR，美国)；MX-F 型固定式混匀仪(DRAGONLAB，美国)。

硫酸铜、微米氧化铜、纳米氧化铜(球形，粒径＜50 nm)(Sigma，美国)；1x 磷酸盐缓冲液(pH 值7.2 ～7.4，索莱宝，北京)；铜标准溶液(1 000 μg/mL，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；浓硝酸(GR)、高氯酸(GR)、乙醚均为国产试剂。

1.2 实验动物及处理 选20 只8 周龄健康海蓝褐壳雏鸡随机分为4 组。 第1 组空白对照组。 第2 ～4 组为试验组，分别以硫酸铜、微米氧化铜(混悬液)、纳米氧化铜(混悬液)形式向腺胃内注入铜100 mg/kg·bw。 对照组注射生理盐水。 给药前24 h禁食，自由饮水。 将受试鸡用乙醚麻醉，通过微创外科手术将十二指肠与肌胃交界处结扎。 之后将嗉囊与下段食管交界处结扎，完成注射后，缝合皮肤。

1.3 饲料及饲养管理 4 周龄雏鸡自由采食低铜玉米豆粕型日粮，饲料配方与营养成分见表1，连续28 d。 自由饮用去离子水。 按常规饲养管理。

表1 基础日粮组成及营养成分(风干基础)/%

1.4 样品的采集与制备 给药前和给药后第1、2、4、6、8、12、24、36 小时，从所有鸡的翅下静脉采血2 mL，肝素钠抗凝。 每次采血前均采用毛细管法监控红细胞压积(PCV)。 最后1 次采血结束后，立即剖杀所有受试鸡，在剖杀后2 min 内取纳米氧化铜组鸡腺胃与肝脏小块组织，在0 ℃条件下，浸润在0.1 mol/L PBS 中迅速切割成1 mm3大小的组织块，转移至0.1 mol/L 的磷酸盐戊二醛固定液中前固定，4 ℃条件下过夜，以备制作TEM 超薄切片。 将所有剩下的靶器官用超纯水冲洗表面，置于75 ℃鼓风干燥箱风干72 h。 器官烘干后称重，研磨成粉末状。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 全血中铜含量的测定 吸取1 mL 全血，放于50 mL 锥形瓶中，加入混合酸15 mL(浓硝酸和高氯酸配比3∶1)，小心煮沸至0.5 mL 澄清溶液，冷却后加5 mL 超纯水以清洗锥形瓶内壁，然后加热至溶液再剩0.5 mL 左右，冷却后转入10 mL 容量瓶，用超纯水定容。 处理好的样品用ICP -OES 测定样品中的铜含量。

1.5.2 腺胃和肝脏中铜含量的测定 分别准确称取约0.1 g 腺胃和约0.5 g 肝脏(风干样，精确至0.000 1 g)，置于50 mL 锥形瓶中，加入混合酸15 mL，先以120 ℃加热30 min 至器官泡沫消解后，加温小心煮沸至0.5 mL 澄清溶液，冷却后加5 mL超纯水以清洗锥形瓶内壁，然后加热至溶液再剩0.5 mL 左右，冷却后转入50 mL 容量瓶，用超纯水定容。 处理好的样品用ICP-OES 测定样品中的铜含量。

1.5.3 TEM -EDS 分析腺胃和肝脏内元素组成制作腺胃组织和肝脏组织的透射电镜超薄切片，采用镍网承载，醋酸双氧铀单染。 通过TEM 观察靶器官和肝脏对纳米氧化铜的摄取情况，对疑似纳米氧化铜颗粒通过EDS 做能谱分析。

1.6 质量控制 铜的加标回收率为96. 55 ±3.24%，变异系数为1.93%。

1.7 数据统计分析 各数据均采用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析和LSD 多重比较。 各组数据均用X±SD 表示。 血铜浓度数据绘制药时浓度曲线并采用DAS 3.0 软件按照非静脉给药途径进行非房室模型参数的计算。

2 结果

2.1 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜对蛋鸡全血铜含量的影响 经腺胃注入硫酸铜、微米氧化铜或纳米氧化铜溶液后，在试验期的2 ～36 h，受试鸡全血铜含量均显著高于对照组(P ＜0.05)，第2、4、6小时，纳米氧化铜受试鸡全血铜含量显著高于硫酸铜组和微米氧化铜组(P ＜0.05)，见表2。

表2 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜对蛋鸡全血铜含量的影响 (μg/L)

2.2 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜经腺胃给药的药-时曲线 硫酸铜组、微米氧化铜组和纳米氧化铜组经腺胃给药后的药-时曲线趋势类似，均先升高后降低，见图1。

图1 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜经腺胃给药后的药-时曲线

2.3 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜经腺胃给药的主要药物代谢动力学参数的比较 蛋鸡经腺胃注入不同铜源36 h，分析各组药代动力学参数发现各组药时曲线下面积(AUC0-∞)差异不显著(P ＞0.05)；纳米氧化铜组的达峰时间(Tmax)显著低于硫酸铜组和微米氧化铜组(P ＜0.05)；纳米氧化铜组的达峰浓度(Cmax)显著高于微米氧化铜组(P ＜0.05)，表明纳米氧化铜经腺胃吸收后在蛋鸡体内吸收速率较快，见表3。

2.4 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜经腺胃给药36 h 后嗉囊和肝脏的铜含量的比较 蛋鸡经腺胃给药不同铜源36 h 后，分析靶器官铜含量发现纳米氧化铜组的腺胃和肝脏铜含量显著高于对照组(P ＜0.05)，硫酸铜组的肝脏铜含量显著高于纳米氧化铜组(P ＜0.05)，表明纳米氧化铜经腺胃吸收后，大量铜被腺胃吸收，而转运至肝脏的铜相对硫酸铜组较少，见表4。

表3 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜经腺胃给药的主要药代动力学参数

表4 硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜经腺胃给药后的器官铜含量 (mg/kg)

2.5 纳米氧化铜经腺胃给药36 h 后腺胃和肝脏中的吸收分布状态 蛋鸡经腺胃注入纳米氧化铜混悬液36 h 后，经TEM 观察，在腺胃组织中发现球形颗粒聚团，EDS 分析发现，A 区域(内含疑似颗粒)内的铜元素峰值显著高于B 区域(对照)，可确定疑似纳米氧化铜颗粒，见图2、图3。 在肝脏中未发现疑似纳米氧化铜颗粒，见图4。 表明纳米氧化铜颗粒能以内吞的方式进入腺胃，但不能转运至肝脏。

图2 纳米氧化铜在腺胃组织内分布情况(TEM 照片) (3 000 ×)

图3 利用EDS 对腺胃组织内纳米氧化铜(铜元素)定性鉴定

3 讨论

图4 纳米氧化铜组肝脏的TEM 照片 (2 000 ×)

硫酸铜是目前应用最广泛的无机铜铜源添加剂，大量使用会增加铜元素的排泄量，造成环境污染[5]。 氧化铜的含铜量为78%，虽然含铜高，但研究表明，其对猪、鸡和牛的生物可利用性均比硫酸铜和碳酸铜低[6]。 田相迪[7-8]等报道，在饲料中添加相同水平的铜，和微米氧化铜相比，肉鸡饲料中添加纳米氧化铜能显著提高血清铜含量和肝脏铜含量，进一步研究发现，纳米氧化铜的表观消化率显著高于硫酸铜和氧化铜。 杜利静[9]通过给小鼠灌服纳米氧化锌证实了尺寸影响氧化锌的摄入。由此可以看出纳米颗粒在消化道吸收可能存在尺寸依赖性。 本实验室前期研究证明，在饲料中添加纳米氧化铜，骨骼铜含量和锌沉积量显著高于添加硫酸铜和氧化铜时，肝脏中的铜沉积以及肝脏中血浆铜蓝蛋白(CP) mRNA 的表达量和血浆CP、Cu -ZnSOD、MAO 活性也显著提高，而小肠、腺胃铜的含量反而降低，表明纳米氧化铜比硫酸铜和氧化铜有更加便捷的吸收途径[10-11]。 此外，在饲料中以硫酸锌形式添加高水平锌，发现没有拮抗纳米氧化铜的吸收利用[3，12]，也再次证明纳米氧化铜吸收利用机制与硫酸铜有较大的差异。

本试验发现，蛋鸡腺胃吸收同水平的硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜的血铜浓度随时间变化，均呈现先升高后降低的趋势；纳米氧化铜经腺胃吸收后Tmax显著低于硫酸铜和微米氧化铜，Cmax显著高于微米氧化铜，说明纳米氧化铜经腺胃吸收速度快、吸收量大。 本试验还发现，和微米氧化铜组和对照组相比，经腺胃给药纳米氧化铜能显著提高全血和腺胃铜含量，且纳米氧化铜组肝脏铜含量显著高于对照组。 经TEM-EDS 技术在腺胃组织中观测到纳米氧化铜颗粒，而在肝脏中未发现类似的颗粒或者聚团，结合本课题组前期的研究[13-14]可以确定，纳米氧化铜颗粒能以内吞途径进入腺胃，然后以铜离子的形式与铜蛋白结合转运到全身器官组织的。