四溴双酚A厌氧共代谢降解性能研究

陈英文,范梦婕,孙靖云,沈树宝 (1.石油石化污染物控制与处理国家重点实验室,北京 1006；.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏 南京 10009)

作为一种广泛应用的溴系阻燃剂[1],四溴双酚 A(TBBPA)在许多生物基质中都有检出[2],对人类健康具有严重危害[3].目前,TBBPA 的主要降解方法包括吸附法[4],光催化[5]和生物降解法[6].能够原位修复污染物的生物降解是目前的研究热点.由于 TBBPA的特殊物化性质使其易沉积于底泥沉积物厌氧环境中,因此研究TBBPA的厌氧降解更具有实际应用价值.Wang等[7]研究发现 Shewanella sp.XB的黄素分泌依赖于TBBPA的初始浓度,当TBBPA初始浓度为80mg/L时,黄素分泌受到了抑制.同时,TBBPA降解产物分析显示厌氧条件下 TBBPA只能被还原脱溴成双酚 A(BPA)而不能进一步转化[8].因此深入研究 TBBPA厌氧降解途径具有重要的实际应用价值.

厌氧共代谢是指通过微生物代谢其他化合物产生的酶或者辅助因子对污染物的降解过程[9-10].很多研究者利用微生物共代谢对环境中难降解有机物进行去除,如 4-烷基酚(4-HBA)[11]和磺胺甲恶唑(SMX)[12].与 TBBPA 相同的是,4-HBA与SMX都具有化学性质稳定,辛醇/水分配系数高,脂溶性强等特点,因此推测厌氧共代谢技术能够实现TBBPA的高效深度降解.

本文基于微生物厌氧共代谢原理,探索TBBPA厌氧共代谢可行性.构建厌氧共代谢反应器,分析研究 TBBPA 的厌氧共代谢降解效率.通过微生物特征菌群以及TBBPA降解途径的研究探讨 TBBPA的厌氧共代谢转化机理,对研究厌氧环境中TBBPA深度降解具有重要科学意义.

1 材料与方法

1.1 反应器的构建与启动

构建两组反应器,分别记为 C-Glu和 C-T,反应器为圆柱形有机玻璃装置,总容量为250mL.菌株来源为南京市某污水处理厂,经葡萄糖底物溶液驯化,培养并保存.将营养液和含有菌株的污泥按照 1:1的比例混合后添加进反应器中,以碳布作为微生物支撑载体,进行驯化挂膜.营养液由以下物质组成:每升水中含葡萄糖 1.00g, NH4Cl 0.31g, KCl 0.13g,Na2HPO4·12H2O 11.88g, NaH2PO4·2H2O 2.55g,MgSO4·7H2O 0.20g 和微量元素 10mL.每 3d 更换一次营养液,当反应出水溶液TOC低于40mg/L,且持续3次反应循环时,表明微生物挂膜完成.挂膜完成后,将两组反应器置于恒定温度(33℃)的分批模式下操作,当反应出水溶液TOC趋于稳定时,更换底物,结束一次反应循环.

1.2 实验方法

以 1g/L葡萄糖作为反应底物加入反应器C-Glu;以1g/L葡萄糖作为共基质,将浓度分别为0,25,50,75,100,200和500μg/L的TBBPA按照葡萄糖溶液与TBBPA溶液体积比为7:3比例混合后依次加入反应器 C-T,并根据葡萄糖在反应系统中的降解特点,分别在12, 24, 36和60h时取样,为了排除数据的偶然性,TBBPA的每个浓度梯度都完成了4次降解反应.

以200μg/L TBBPA为唯一碳源,在反应12h时取样并通过质谱分析中间代谢产物;以1g/L葡萄糖和200μg/L TBBPA混合溶液为碳源,在反应12h时取样并通过质谱分析中间代谢产物.

1.3 分析方法

1.3.1 样品的检测与分析 ①样品预处理.从反应器中取15mL出水样品与15mL二氯甲烷混合后,震荡萃取10min,随后将萃取液旋蒸至干.用甲醇定容到 3mL,用孔径为 0.22μm 的有机系滤膜进行过滤,完成样品准备.将处理好的样品通过高效液相-质谱联用仪进行检测.②质谱条件.通过电喷雾电离(ESI)离子源,负离子模式及多反应监测(MRM)对目标产物进行定性分析.气帘气(CUR),喷雾气(GS1),辅助加热气(GS2)和碰撞气(CAD)的压力分别为 206851.8, 241327.1,275802.4和 41370.36Pa,源温度为 400℃,离子化电压(IS)为 5500V,母离子峰和子离子峰分别为542.7和417.9,碰撞能(CE),去簇电压(DP),入口电压(EP),碰撞室出口电压(CXP)分别为-53, -75,-7和-10V.③液相色谱条件.在ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(150mm×2.1mm,3.5μm), 0.02%(V/V)氨水(A)/50%甲醇(B)作流动相,柱温为40℃,进样量为5μL的条件下对TBBPA进行定量分析.测量时所采用的流动相梯度见表1.

表1 分析TBBPA的流动相梯度Table 1 Gradient elution program for the analysis of TBBPA

1.3.2 生物多样性分析 待反应完成后,从不同反应体系中的阳极生物膜上取生物膜样品作为检测对象,反应器C-Glu中生物膜记为C-Glu,反应器C-T中生物膜记为C-T.将生物膜样品送至上海美吉生物医药科技有限公司在 Illumina平台上利用细菌16S rRNA测序分析微生物多样性.

1.3.3 计算方法 TBBPA的产物通过质谱进行分析,TBBPA的浓度通过高效液相-质谱联用仪(HPLC-MS)进行检测.TBBPA去除率的计算方法为:

反应一级速率常数的计算公式为

式中:C0为 TBBPA 的初始浓度,μg/L;Ct为TBBPA在反应时间为t时的浓度,μg/L;k为速率常数.

TBBPA半衰期的计算公式为

式中:ΔRT为TBBPA的去除率;C1为TBBPA的进水浓度,μg/L;C2为 TBBPA 的出水浓度,μg/L;t为反应时间;T为TBBPA的半衰期.

2 结果与讨论

2.1 TBBPA降解效率分析

TOC代表溶液中总有机碳成分,即溶液中微生物能够直接代谢的总碳源.在 12h前,溶液TOC快速下降(图1),TOC去除率达到60%左右(图2),12h后溶液TOC下降缓慢(图1).当出水溶液TOC低于40mg/L时,完成一次反应循环,即此时反应溶液中的有机碳源已不足以供给微生物,微生物处于饥饿状态.当第二批次营养底物加入时,微生物的代谢活性能够迅速提高直至营养物被消耗,之后微生物的活性又回复到较低水平,从底物加入至底物耗尽,微生物经历饱腹至饥饿的循环.因此,12h后直至反应完成的TOC下降幅度小于在12h前的下降幅度.由图1和图 2亦可知随着 TBBPA浓度的升高,出水TOC升高,TOC去除率下降,一方面是因为TBBPA对微生物的毒性作用[13],一方面是由于TBBPA的物化性质与化学结构使其难于被微生物代谢及转化.

不同浓度TBBPA在厌氧共代谢条件下的降解动力学分析如表2所示.由表2可知,在厌氧共代谢条件下,TBBPA的降解符合一级动力学方程.而有机化合物的生物半衰期代表了其在生物条件下的转化及降解速度,TBBPA的生物半衰期及降解时间随着 TBBPA浓度的升高而升高,最低生物半衰期为 25μg/L时的 21.9h,最高生物半衰期为500μg/L时的64.4h,相比于自然环境及其它研究者报道(表 3),厌氧共代谢显著缩短了TBBPA的生物半衰期.由图3可知,浓度为75μg/L时的TBBPA在不同时间点去除率都高于其他浓度,结合不同浓度 TBBPA在反应完成时最终去除率都高于75%的分析可知,TBBPA在厌氧共代谢体系中被还原脱溴,进一步地,结合 TOC分析(图 1和图 2)可知,在厌氧共代谢体系中 TBBPA很大程度上被共代谢分解而成为微生物可利用的碳源.因此,TBBPA在厌氧共代谢体系中实现了有效降解.

图1 不同TBBPA浓度条件下TOC随时间变化趋势Fig.1 TOC of different concentrations of TBBPA at different time points

图2 不同TBBPA浓度条件下TOC去除率随时间的变化规律Fig.2 TOC removal rates of different concentrations of TBBPA at different time points

表2 不同浓度下TBBPA的降解动力学研究Table 2 Kinetic results of TBBPA with different conentrations

表3 不同研究所做TBBPA厌氧降解效率对比Table 3 The comparison of anaerobic degradation efficiency of TBBPA by different researches

图3 不同TBBPA浓度条件下TBBPA去除率随时间的变化规律Fig.3 The removal rate of TBBPA with different concentrations at different degradation time

2.2 TBBPA厌氧共代谢途径

已有研究证明在厌氧环境中 TBBPA只能被还原脱溴为BPA[8],不能进一步进行生物转化.本文也对以 TBBPA为单一碳源的厌氧降解进行了实验,分析发现 TBBPA的厌氧代谢终产物除了BPA未有其他单环产物检出.而厌氧共代谢系统中代谢产物不仅存在BPA(图4A),还存在单环产物3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯(图4B).有研究表明苯甲酸和对羟基苯甲酸都可以被微生物有效降解[17],因此推测化学结构相似于苯甲酸和对羟基苯甲酸的 3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯也是一种易于降解的化合物,充分证明了 TBBPA在厌氧共代谢系统中能够被深度降解.

图4 TBBPA的中间代谢产物Fig.4 The mass spectrometry analysis of TBBPA degradation products

图5 TBBPA在厌氧共代谢系统中的降解途径Fig.5 A proposed degradation pathway of TBBPA in conventional co-metabolic reactor

作为 TBBPA 厌氧共代谢的共基质,葡萄糖一方面缓解 TBBPA对微生物的毒性[18],另一方面为TBBPA 的分解及转化提供质子和电子.厌氧还原脱卤作用是芳香族化合物在环境中矿化的关键步骤[19].由图4可知,在厌氧共代谢条件下,TBBPA首先厌氧还原脱溴成 BPA,随后通过氧化,分解及其它共代谢协同作用将BPA转化成单环产物3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯,并最终将TBBPA转化成H2O和CO2,实现TBBPA的深度降解(图5).

当以葡萄糖为共代谢底物时,不仅检测到了双环产物双酚A,还检测到了TBBPA的单环产物.结合 TBBPA的生物半衰期(表 2)和反应结束时不同浓度下 TBBPA 去除率(图 3)分析可知,TBBPA在反应体系中是被共代谢降解而非其他代谢方式.

2.3 微生物特征分析

在Illumina平台通过16S rRNA对反应完成后的菌群进行微生物多样性分析,确定代谢转化TBBPA的特征菌群.香农指数被认为是微生物多样性指数,香农曲线越平缓表明测序数据量足够大,能反映微生物样品中的大部分信息[20],C-Glu反应体系和 C-T反应体系中香农指数分别为3.46和3.60,这表明TBBPA的加入引起了C-Glu和C-T两个样品之间微生物多样性的差异.

由图6可知,在厌氧共代谢系统中,只以葡萄糖为降解底物时,Blvii28_wastewater-sludge和PHOS-HE36两种菌株为主要菌属, Blvii28_wastewater-sludge通常在厌氧废水或淡水环境中,是污泥中的典型菌属[21],PHOS-HE36是一种能够以葡萄糖作为碳源的厌氧菌属[22].而相较于厌氧共代谢系统,TBBPA厌氧共代谢体系中固氮弧菌属和毛球菌属所占丰度比例分别为 11%和19%.这种现象的发生说明TBBPA的加入促使固氮弧菌属和毛球菌属丰度增加,成为了C-T反应体系中的优势菌属.固氮弧菌属属于变形菌门,是一种兼性厌氧产电菌,最主要的两个特征是利用有机碳作为碳源及对氮的固定[23].近年来,很多研究者集中于固氮弧菌属对苯系物(BTEX)降解能力的研究[24].另外,研究者发现固氮弧菌属可以有效降解高效氯氰菊酯[25].毛球菌属属于厚壁菌门,是一种常从污泥中分离出来的兼性厌氧菌,能够在厌氧反应器中处理有机废水[26].同时,Sun等[27]发现毛球菌属具有能够降解刚果红的能力,而刚果红为一种极难生物降解的联苯胺类偶氮染料.因此,结合 TBBPA 降解途径,TBBPA 降解效率分析,可以推测固氮弧菌属和毛球菌属是厌氧共代谢降解TBBPA的特征菌属.

图6 微生物群落组成图(属)Fig.6 The composition of microbial community (genus)

3 结论

厌氧共代谢降解 TBBPA研究表明,在 12h时,溶液TOC去除率达到60%左右,最低生物半衰期为 25µg/L时的 21.9h,最高生物半衰期为500µg/L时的64.4h,浓度为75µg/L时的 TBBPA去除率最高,且不同浓度 TBBPA的去除率都高于70%.微生物群落结构及TBBPA中间代谢产物分析表明固氮弧菌属和毛球菌属为代谢TBBPA的特征菌属.

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