氯嘧磺隆降解菌的筛选及对污染土壤的生物修复

王海兰 ,臧海莲 ,成 毅 ,安雪姣 ,徐春红 ,李春艳 * (.东北农业大学资源与环境学院,黑龙江 哈尔滨5000；.中国农业大学理学院,北京 0008；.牡丹江友搏药业有限责任公司,黑龙江 牡丹江 57000)

氯嘧磺隆是美国杜邦公司于20世纪80年代研制的一种磺酰脲类除草剂,被广泛用于大豆田选择性防除阔叶杂草、莎草及某些禾本科杂草.该除草剂残效期长(2～3年),长期大量重复施用极易对后茬敏感作物产生药害,阻碍大豆田的合理轮作,对生态环境和人类健康存在着巨大的潜在威胁[1-2].磺酰脲类除草剂在土壤中的降解主要包括光解、化学水解和微生物降解,其中微生物降解技术因具有时间短、不产生二次污染等优点而受到广泛关注[3-5].因此,获得可修复氯嘧磺隆污染土壤的高效降解菌株以减轻氯嘧磺隆对后茬作物的药害及环境的污染具有重要的理论和现实意义[6-10].

目前,一些氯嘧磺隆降解微生物已被分离和鉴定,主要有曲霉菌属、芽孢杆菌属、念珠菌属、链霉菌属、假单孢菌属、诺卡氏菌属、寡养单胞菌属、掷孢酵母属、丛梗孢科曲霉属等[11-15].除对降解微生物分离鉴定及降解条件优化外,研究人员还考察了部分菌种对氯嘧磺隆污染土壤的修复能力,汪佳秀等[16]利用克雷伯氏菌研究了其对被氯嘧磺隆污染土壤的生物修复作用,并以小麦、玉米、黄瓜为供试植物,研究了该菌株对氯嘧磺隆药害的缓解作用.但是,利用胶红酵母菌修复氯嘧磺隆污染土壤的研究尚未有报道.

本研究分离获得 1株能以氯嘧磺隆为唯一碳源生长的氯嘧磺隆高效降解菌,根据菌株最佳降解条件,考察土壤温度、土壤pH值、土壤含水量以及接种量对降解菌降解土壤中氯嘧磺隆的影响,优化菌株对土壤中氯嘧磺隆的降解条件.通过敏感作物盆栽实验检测降解菌对氯嘧磺隆污染土壤的修复效果.以期丰富氯嘧磺隆降解菌菌种资源,降低残留氯嘧磺隆对后茬作物的药害,为实际氯嘧磺隆污染土壤修复提供有价值的参考.

1 材料与方法

1.1 菌株筛选及土壤采集

污泥样品采自江苏某激素研究所污水处理池(连续生产磺酰脲类除草剂20余年).

供试土壤为经检测无氯嘧磺隆残留的自然土(NS),取自东北农业大学试验田,取 0～30cm 深耕层土壤,过筛(孔径 2mm)、风干后备用,用于进行氯嘧磺隆污染土壤生物修复试验、盆栽试验.经测定可知:土壤 pH 6.23,全氮含量 93.5mg/kg,全磷含量为 42.1mg/kg,全钾含量为 416.9mg/kg,含水率为3.6%.

1.2 培养基

无机盐基础培养液:K2HPO40.1g,CaSO40.04g,MgSO4·7H2O 0.2g,NaCl 0.1g,(NH4)2SO40.1g,FeSO4·7H2O 0.001g,加蒸馏水至 1L,121℃灭菌30min.

YPD 培养基(酵母膏胨葡萄糖培养基):酵母膏 10g,蛋白胨 20g,葡萄糖 20g,加蒸馏水至 1L,112℃灭菌20min.

以上培养基在配制固体培养基时按2%添加琼脂粉,按照实验要求调节pH值.

1.3 主要仪器与试剂

实验所用氯嘧磺隆(分析纯,96.02%)购自江苏激素研究所有限公司.Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司;所用有机试剂均为色谱纯,其余试剂均为国产分析纯.所用引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成.

使用的主要仪器有:AgelienT1100高效液相色谱仪(美国安捷轮)、SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台(苏州净化)、SPX-250B-Z生化培养箱(上海博讯)、YXQ-SG46-280S手提式压力蒸汽灭菌器(上海博讯)、TU-1810分光光度计(北京普析)等.

1.4 氯嘧磺隆降解菌分离

采用富集培养方法,以氯嘧磺隆为唯一碳源,富集培养污泥样品.具体步骤如下:取污泥样品10g放入装有90mL无菌生理盐水和玻璃珠三角瓶中,振荡约20s至样品形成均匀悬浊液.以10%接种量转接于装有 40mL氯嘧磺隆无机盐培养基 250mL三角瓶中,氯嘧磺隆浓度为 100mg/L,置于 30℃,165r/min恒温摇床培养,每隔 7d按10%接种量接入新鲜氯嘧磺隆无机盐培养基中,以一定浓度梯度提高氯嘧磺隆含量,至终浓度达到 1000mg/L,如此驯化约 2个月[17].于氯嘧磺隆终浓度为 500mg/L基础无机盐平板上采用平板划线法分离纯化 3～4次,选择生长较好的菌株分别回接于含 100mg/L氯嘧磺隆无机盐基础培养液中,测量其生长量(OD600)及降解率,进行后续实验研究.

1.5 氯嘧磺隆降解菌鉴定

采用平板划线法将氯嘧磺隆降解菌接种于无机盐基础固体培养基,30℃恒温培养5d后观察菌落形态.

利用细菌16S rDNA的27F/1492R通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'和1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3',ITS序列的通用引物 ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-C-3'及酵母菌26S rDNA的D1/D2通用引物N L1:5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和 NL4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'分别扩增降解菌株的16S rDNA区域序列、ITS1-5.8S-ITS2的ITS区域序列和26S rDNA D1/D2区域序列.扩增反应体系为:10×buffer (Mg2+) 5µL,dNTPs(2mmol/L) 4µL,上下游引物(20pmol/µL)各 1µL,菌体 DNA(50ng/µL) 1µL, Taq DNA 聚合酶(5U/µL) 0.5µL,加ddH2O至50µL. PCR反应条件:95℃ 5min,94℃ 30s,56℃ 30s, 72℃ 90s,3 0个循环,72℃ 10min.测序结果提交 NCBI进行BLAST比对分析,采用软件DNAMAN 8.0构建系统发育树.

1.6 氯嘧磺隆降解菌降解率测定

氯嘧磺隆浓度采用高效液相色谱 Waters 600检测.色谱柱为 symmetry-C18反相柱(250mm×4.6mm,i.d.5µm),紫外检测器为 Waters 2487,流动相为甲醇:水=70:30(V/V),冰乙酸调节pH 值,流量 1.0mL/min,波长 254nm,进样量 20µL,柱温 25℃.氯嘧磺隆采用外标法定量分析.采用Empower Software(Waters,MA,USA)记录和计算氯嘧磺隆峰面积,得出菌株LCY-4氯嘧磺隆降解率[18-19].

降解率计算公式:

式中:A0-未接菌对照培养液中氯嘧磺隆含量;A-接菌处理培养液中氯嘧磺隆含量.

1.7 氯嘧磺隆降解菌降解条件优化

分别以24、26、28、30、32、34、36、38℃作为温度实验组,分别以5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5作为pH值实验组,分别以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%作为接种量实验组.以上各实验组均使用 100mL含氯嘧磺隆浓度为100mg/L的无机盐培养液.每实验设3个处理,同时设加药但不加菌悬液的处理为对照.180r/min恒温振荡培养5d后,分别测定菌株生长量OD600及氯嘧磺隆降解率,考察不同因素对LCY-4降解氯嘧磺隆的影响.

1.8 氯嘧磺隆降解菌对污染土壤中氯嘧磺隆降解条件优化

1.8.1 降解菌对灭菌及未灭菌污染土壤中氯嘧磺隆的降解 在降解菌降解条件优化基础上,土壤中添加氯嘧磺隆浓度为 10mg/kg (干土),检测降解菌LCY-4在灭菌土壤及未灭菌土壤中的降解率,同时设定未投加降解菌LCY-4的灭菌土壤及未灭菌土壤作为对照组.

1.8.2 不同因素对降解菌降解土壤中氯嘧磺隆的影响 取过筛土壤 50g,氯嘧磺隆添加量为10mg/kg (干土).分别以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%作为接种量实验组,分别以20、25、28、30、33、38℃作为温度实验组,分别以5.0、5.5、6.0、6.75、7.0、7.5、8.0作为土壤pH值实验组,分别以 10%、20%、30%、40%、50%、60%为土壤含水量实验组.除接种量实验组外,其他各组均以2.5%的接种量接种LCY-4;除培养温度实验组外,其他各组均于28℃条件下培养;除土壤pH值实验组外,其他各组土壤均为自然pH值(6.75);除土壤含水量实验组外,其他各组土壤含水量均为田间最大持水量的40%.静息培养30d后,采用高效液相色谱测定氯嘧磺隆残留量,计算降解率.

整个实验阶段适时补水,保持含水量不变,每实验设 3个重复,同时设加药但不加菌悬液的处理为对照.在以上最佳降解条件下,静息培养 30d后采用高效液相色谱测定氯嘧磺隆残留量,计算降解率.

1.9 氯嘧磺隆降解菌对污染土壤上小麦苗期生长的影响

土壤过筛,分装于花盆中,每盆3kg,空白对照组只添加土壤;实验对照组添加氯嘧磺隆浓度为10mg/kg的土壤,配制好的药液均匀喷洒在土上,边喷边搅拌,使药液与土壤混拌均匀;实验组将降解菌LCY-4以2.5%接种量添加于氯嘧磺隆浓度为10mg/kg的土壤中.所有处理于28℃条件下静息培养,实验阶段保持含水量恒定[18].

投加降解菌10d后,选取经清水浸种、催芽、萌发一致的小麦种子,分别播种于各处理土壤中,每盆播种10粒.于28℃条件下静息培养,第3d时测定出苗率,继续培养15d后测定幼苗株高,幼苗根长,植株鲜重,用数据统计学进行相关分析.

1.10 数据处理

所有的实验结果为 3次重复的平均值,实验数据分析和制图采用Origin8.0软件完成.

2 结果与讨论

2.1 氯嘧磺隆降解菌的筛选

采用富集、驯化培养方法,从连续生产磺酰脲类除草剂20余年的江苏某激素研究所污水处理池污泥样品中分离出1株氯嘧磺隆降解菌,该菌株能以氯嘧磺隆为唯一碳源进行生长,对氯嘧磺隆具有较高的降解能力,命名 LCY-4.LCY-4的菌体形态呈卵形或球形,大小为 2.0～5.0µm,单一、成对,不形成子囊孢子或担孢子.单一菌落形态为圆形,表面凸起,边缘整齐,不透明,湿润,粘稠,在 YPD培养基上菌落为橙红色.在液体培养基中,液体表面不形成菌膜,菌液均匀混浊,无起泡现象.

2.2 氯嘧磺隆降解菌分子生物学鉴定

图1 菌株 LCY-4 基于26S rDNA基因序列的系统发育树Fig.1 A phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence of strain LCY-4

以菌株基因组DNA为模板,以16S rDNA的通用引物 27F/1492R、ITS区的通用引物ITS1/ITS4及26S rDNA的通用引物NL1/NL4对菌株LCY-4进行PCR扩增,测序结果提交NCBI进行BLAST比对,结果显示,菌株LCY-4的5.8s ITS区段基因序列与 Rhodotorula mucilaginosa同源性最高,达99%;菌株LCY-4的26Sr DNA区段序列与Rhodotorula mucilaginosa聚为一族,与菌株 Rhodotorula mucilaginosa CBS428(AF189661)的相似度为99.95%(系统发育关系见图 1).确定菌株 LCY-4为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)的一个菌株.菌株LCY-4序列已在GenBank中注册,登录号为JF506740.

2.3 氯嘧磺隆降解菌降解条件优化

图2 不同因素对降解菌LCY-4生长及氯嘧磺隆降解能力的影响Fig.2 Effects of different factors on strain LCY-4 growth and chlorimuron-ethyl degradation

不同因素对菌株LCY-4生长量及氯嘧磺隆降解率影响见图2. LCY-4的最适生长及降解温度为28℃,此温度下其最大生长量及降解率分别为1.70和81.03%.菌株LCY-4的最佳生长及降解 pH值为 6.0,其最大生长量及降解率分别为1.532和82.46%.菌株LCY-4在接种量为2.5%时,生长量为 1.68,此时降解率亦达到最大 81.1%.最佳条件下,在含100mg/L氯嘧磺隆的无机盐培养基中培养5d后,菌株LCY-4降解率为87.33%.

2.4 氯嘧磺隆降解菌对污染土壤中氯嘧磺隆降解条件优化

2.4.1 降解菌对土壤中氯嘧磺隆的降解能力图3表示土壤中氯嘧磺隆初始浓度10mg/kg (干土),降解菌 LCY-4在灭菌土壤及未灭菌土壤中的降解曲线.由图 3可知,灭菌的对照组(CK1)氯嘧磺隆本身存在一定程度的降解,在第 30d氯嘧磺隆降解率达到 9.03%,表明土壤中氯嘧磺隆的降解有一部分是非生物作用引起的,而未灭菌的对照组(CK2)在0～10d氯嘧磺隆降解效果与CK1区别不大,在15～30d降解率逐渐升高,第30d氯嘧磺隆降解率达到36.87%,说明氯嘧磺隆的添加可能诱导了某些自然状态下土著微生物对氯嘧磺隆降解作用,但作用缓慢且降解率较低[18].

投加降解菌LCY-4于灭菌的氯嘧磺隆污染土壤处理组(TR1)降解率明显高于对照组(CK1),第30d菌株LCY-4在TR1处理中对氯嘧磺隆的降解率为 81.54%,表明降解菌 LCY-4对氯嘧磺隆有较高的降解能力.降解菌LCY-4投加于未灭菌的氯嘧磺隆污染土壤处理组(TR2)降解率略高于降解菌LCY-4投加于灭菌氯嘧磺隆污染土壤处理组(TR1),第30d菌株LCY-4在TR2处理组中的降解率达到 85.21%,表明降解菌株 LCY-4添加提高了土壤中氯嘧磺隆的降解.后续实验选择未灭菌的自然土壤作为研究对象.

2.4.2 菌株对土壤中氯嘧磺隆降解条件的优化 不同因素对菌株LCY-4降解土壤氯嘧磺隆的影响见图4.降解菌株LCY-4以不同的接种量添加到土壤中,其降解效果如图 4a所示.降解菌的加入,促进了土壤中氯嘧磺隆的降解.尽管微生物只有在数目上达到一定规模才能实现对底物的高效降解,但接种量并非越大越好,当接种量达到一定程度后,继续增加接种量对底物降解能力影响不大,实际应用不经济,寻求能达到氯嘧磺隆降解要求的最适接种量有利于生物修复过程中菌种培养的成本控制[19-20].菌株LCY-4在接种量为 2.5%和 3.0%时,降解率分别为 83.74%和84.11%,差别相对较小,后续实验以 2.5%的接种量添加.

图3 降解菌株 LCY-4 在灭菌土壤及未灭菌土壤中对氯嘧磺隆的降解Fig.3 Chlorimuron-ethyl degradation by strain LCY-4 in sterile and unsterile soil

培养温度对高效降解菌LCY-4降解氯嘧磺隆的影响结果见图 4b.结果表明,随着培养温度的升高降解率呈现先上升后下降的趋势,在 25～30℃范围内,降解菌株整体降解能力较好,降解率均在 70%以上,其最高降解率出现在 25℃,为87.66%,较高温度对降解菌株降解能力的抑制作用明显,当温度升至 28℃时,降解率略有降低,为82.27%.

土壤pH值对高效降解菌LCY-4降解氯嘧磺隆的影响结果见图4c.结果表明,在土壤pH为5.0～8.5范围内,菌株降解能力均大于 50%,表明降解菌LCY-4具有较强的土壤适应性,当pH值低于6.0时,LCY-4的降解能力随pH值的升高而增强,当pH值高于6.0时,菌株降解能力随之减弱.菌株LCY-4的最适降解pH值为6.0,此条件下降解率为88.33%.

土壤含水量对高效降解菌LCY-4降解氯嘧磺隆的影响结果见图 4d.结果表明,当土壤中含水量为田间最大持水量的 10%～60%范围内,降解菌株表现出较强的降解能力,当土壤中含水量在 10%～30%之间,菌株降解能力随着含水量的升高而升高,当含水量在 30%～40%之间时,降解率随着含水量升高呈现下降趋势,当含水量在40%～60%之间时,降解率随之呈现出缓慢下降趋势,变化不大.当菌株LCY-4在含水量为30%时,降解率最高,为86.33%.

图4 不同因素对土壤中氯嘧磺隆降解的影响Fig.4 Effects of different factors on chlorimuron-ethyl degradation by strain LCY-4 in soil

最佳条件下,当接种量 2.5%、温度 25℃、pH 6.0、土壤含水量 30%时,静息培养 30d后,氯嘧磺隆降解率达到 90.74%,表明氯嘧磺隆高效降解菌 LCY-4对土壤中的氯嘧磺隆存在较高的降解能力.

2.4.3 降解菌株对氯嘧磺隆污染土壤的修复作用 播种小麦3d后,出苗情况如图5所示,空白对照的出苗率达到 90%,而添加氯嘧磺隆的土壤明显抑制小麦出苗率,出苗率仅 70%;投加 LCY-4于氯嘧磺隆污染土壤的处理组,出苗率达到85%,结果表明降解菌的加入有效减轻了氯嘧磺隆对小麦出苗率的抑制作用,由此可见,降解菌可有效缓解氯嘧磺隆对小麦种子发芽的毒害作用,具有一定的应用潜能.

播种 15d后,小麦幼苗株高、根长及鲜重如图 6所示.氯嘧磺隆污染土壤中小麦幼苗株高、根长及鲜重明显低于未污染土壤生长的小麦(P<0.05),表明氯嘧磺隆的残留对小麦幼苗生长有一定的抑制作用.投加降解菌LCY-4的氯嘧磺隆污染土壤中小麦株高、根长及鲜重[分别为(28.25±2.72)cm、(7.48±0.17)cm、(0.25±0.01)g]明显大于未加入降解菌的氯嘧磺隆污染土壤生长的小麦株高、根长及鲜重[分别为(23.20±1.74)cm、(6.42±0.10)cm、(0.19±0.02)g](P<0.05),说明施用降解菌LCY-4可降低氯嘧磺隆对小麦幼苗的药害.结果表明,高效降解菌株 LCY-4对土壤中的氯嘧磺隆具有一定的降解,从而降低对小麦幼苗的药害.

图5 LCY-4 修复氯嘧磺隆污染土壤对盆栽小麦出苗率影响Fig.5 The effect of chlorimuron-ethyl-contained soil bioremediation by strain LCY-4 on wheat seedling emergence

图6 LCY-4修复氯嘧磺隆污染土壤对小麦生长状况的影响Fig.6 The effect of chlorimuron-ethyl-contained soil bioremediation by strain LCY-4 on wheat seeding growth

氯嘧磺隆是一种超高效、长残留性除草剂,植株苗期是植物生长的敏感阶段,除草剂药害首先会体现在植物生长的敏感时期[21].本研究选取盆栽土培法种植对氯嘧磺隆比较敏感的农作物小麦,考察降解菌的投加对氯嘧磺隆药害的解除效果,以及对敏感作物的影响,为该降解菌在大田生产实际应用中提供参考.

应用微生物降解土壤中污染物具有环保高效的优点,但微生物与土壤微环境的相互作用机制[22],高效降解菌在不同土壤条件下(如盐碱地、岩性土等)降解能力以及适应性,土壤微生物群落的改变以及微生物降解技术在农业生产实践中的生态风险评估等仍有待进一步探讨.

3 结论

3.1 本研究以氯嘧磺隆为目标污染物筛选获得的 1株高效氯嘧磺隆降解酵母菌,经菌株形态特征和26S rDNA序列分析,鉴定该菌株属胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa),命名为LCY-4.

3.2 利用单因素实验对菌株 LCY-4在含氯嘧磺隆的无机盐培养基中优化降解条件为:接种量2.5%,培养温度 28℃,pH 6.0,在含 100mg/L氯嘧磺隆的无机盐培养基中培养 5d后,降解率为87.33%.

3.3 菌株 LCY-4在氯嘧磺隆初始浓度为10mg/kg(干土)的土壤中,最佳降解条件为:接种量2.5%、温度25℃、pH 6.0、土壤含水量30%,静息培养30d后,氯嘧磺隆的降解率为90.74%.

3.4 当土壤中氯嘧磺隆的浓度为 10mg/kg时,投加降解菌LCY-4后,小麦的出苗率、株高、根长及鲜重均明显高于未投加降解菌的对照组(P<0.05).盆栽实验结果表明,施用降解菌 LCY-4可减轻氯嘧磺隆对小麦幼苗的药害.

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