微流体控制技术制备丝素蛋白微球的研究

陈 岭,雷 鸣，张德锁，3

( 1.国家知识产权局专利局专利审查协作江苏中心，江苏 苏州 215163; 2.苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215021; 3. 现代丝绸国家工程实验室(苏州)，江苏 苏州 215123)

蚕丝是一种天然蛋白质纤维，自古以来一直是高档纺织品的原料，具有“纤维皇后”的美誉[1]。丝素蛋白是蚕丝的主要组成和利用部分，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸构成，具有优异的力学性能，良好的生物相容性和生物降解性等特性，在生物医用领域表现出独特的研究开发和应用潜力[2]。目前，已利用丝素材料开发研究了多种形式的生物医用材料，如丝素蛋白膜、多孔支架、纳米纤维网、水凝胶等，在人工皮肤、人工韧带、骨再生、生物传感器等方面具有广泛的应用前景[3-5]。

利用丝素材料制备的蛋白微球不仅具有生物相容性好、比表面积大、分散性好、生物降解快的特点，同时其流动和扩散性能佳，是药物传输、药物缓释、酶固定剂、靶向治疗的良好载体[6]。目前，制备丝素蛋白微球的方法主要有自组装法、乳化法、盐析法、喷雾干燥法、高压静电分化法等[7]。这些方法制备的蛋白微球往往存在颗粒大小不均匀、粒径分布广，或者工艺复杂、制备周期长等缺点[8]。微流体控制技术是利用微流控装置中的微通道系统来达到控制微尺度液体的一种技术[9]。其具有以下优点：微球大小易于控制，粒径均一，单分散性高；易于控制制备不同结构的微球；完全无毒、无污染；自动化程度高，操作简便。

本研究自主设计了制备丝素蛋白微球的微流体控制装置，并通过微流体控制技术操纵互不相溶的两相流体，制备尺度均一、结构可控的丝素蛋白微球。探讨了丝素蛋白微球的成型原理，优化了制备工艺，并对制备的蛋白微球进行了表征。

1 材料与方法

1.1 丝素蛋白溶液的制备

将100g家蚕生丝置于4L浓度为0.05%的Na2CO3水溶液中，98～100°C下煮练30min，取出后在60℃的去离子水中进行清洗，重复三次煮练和清洗操作使丝胶充分去除。60 °C恒温鼓风干燥箱中烘干备用。

取10g脱胶后的丝素纤维，添加到50mL浓度为9.3mol/L的LiBr水溶液中，60°C下搅拌1.5h使其溶解。利用分子量为8～12 kDa的透析袋对上述溶解的丝素纤维进行透析处理4天，以除去LiBr。将透析得到的丝素蛋白溶液过滤和离心处理后装入试剂瓶中保存于4℃冰箱中备用。

所制备的丝素溶液浓度计算如下：将洗净烘干的表面皿称重，得到皿重W (g)。用移液枪取1mL丝素蛋白溶液滴入到表面皿中后称重W1(g)，放入80°C烘箱中4 h后取出称重，以后每隔20分钟称重一次，直到重量不再变化时记下数据为W2(g)。依据计算公式(1)计算得到丝素蛋白溶液的浓度C(%)，多次取样称重计算后取平均值。

(1)

1.2 丝素蛋白微球的制备

以浓度为4%～6%的丝素溶液为内相，1%～4%浓度的Span-80液体石蜡溶液为外相，3%的戊二醛液体石蜡混合溶液为反应相，构建丝素微球的生成反应系统。控制连续相与分散相的流速至连续形成稳定的丝素乳液液滴。调节反应相的搅拌速度为160r/min，交联反应2h，得到尺寸均一、结构规则的丝素蛋白微球。

将搅拌反应后的丝素微球进行离心(转速 6 000r/min，温度4℃，时间15min)，去除上层石蜡混合物后加入异丙醇溶液使小球充分固化，用超声振荡器震荡使异丙醇与微球颗粒充分接触，再次离心。重复上述步骤三次后，加入去离子水并超声震荡，离心清洗去除表面残留溶液与杂质，反复进行此步骤至少六次。将含有丝素蛋白微球的水溶液放入真空干燥箱中干燥后获得固体丝素微球。

1.3 丝素蛋白微球的表征

(1)丝素乳液形貌的表征

取适量制得的丝素乳液于载玻片上，放置在光学显微镜下观察液滴的形貌，并拍摄光学显微镜照片。

(2)丝素微球形貌的表征

将清洗后分散在水中的丝素微球滴加到硅片上，真空干燥后喷金90s，利用S-4800型扫描电子显微镜(日立，日本)，在3kV电压、10mA电流下观察样品表面形貌，拍摄SEM图片。

(3)丝素微球粒径测试

取干燥的丝素微球样品悬浮于去离子水中，并超声分散，取1 mL的丝素微颗粒悬液置于样品池中，采用激光粒度分析仪测定样品的平均粒径，每个样品重复三次，并与SEM图片进行比较。

2 结果与讨论

2.1 微流体控制技术制备丝素蛋白微球的原理

(a)原理示意图 (b)自制实物图图1 微流体控制核心装置

液滴微流控是微流控技术的一个重要分支，通过操纵互不相溶的两相或多相流体的流动，制备单分散的单乳液、双乳液或多乳液。通过对微流体管道结构的独特设计，结合注射泵或压力系统控制不相溶液相的进样速度，利用流体间的流动剪切力、黏力和表面张力的相互作用，将连续流体分割成离散的微纳米级液滴[10]。本研究为制备丝素蛋白微球，设计制备了一种同轴型微流体控制装置(如图1所示)，以含有Span-80的液体石蜡为连续相，丝素水溶液为分散相,利用流量泵控制两相流体的速度。在同轴通道中，由于液体石蜡的剪切作用，得到尺寸均一的油包水乳液，并通过丝素蛋白溶液自身的粘度和石蜡中的表面活性剂作用形成稳定的微液滴。图2为微液滴的形成过程照片，如图2a所示，丝素溶液从通道中挤出，在通道口聚集。随着聚集量的增加，逐渐形成冠球状，并在流动相的剪切作用下拉伸，并发生颈缩，如图2b所示。随后，脱离丝素溶液通道，形成丝素微液滴(图2c)。

图2 微液滴形成过程图片

当微液滴进入反应器中时，通过搅拌使微液滴充分与戊二醛接触，戊二醛具有两个反应活性醛基，可以作为氨基分子的非特异性偶联剂，与丝素蛋白分子中赖氨酸的ε-氨基、肽链N-端氨基、杂环上亚胺基、巯基及酰胺基团反应发生稳定的交联，形成不溶于水的交联聚合物或凝胶[11]。最后，再利用异丙醇使其充分固化，洗涤后得到尺寸均一的丝素蛋白微球。

2.2 工艺条件对成球性能的影响

为获得稳定的丝素蛋白微球，优化制备工艺条件，研究探讨了丝素溶液浓度和表面活性剂浓度对丝素微球成球效果的影响。

(1)丝素浓度对乳液成球效果的影响

图3 不同丝素浓度所制备的乳液微球光学显微镜图

由于丝素溶液的浓度会影响到分散相的粘度，继而会影响到微流控成乳过程的流型[12]，因此要确定较优的丝素溶液浓度，保证成乳过程稳定进行。当表面活性剂浓度为4%时，调节丝素溶液浓度为4%、5%和6%，通过光学显微镜观察所形成的乳液微球形貌如图3所示。当丝素浓度为4%时，由于丝素浓度较低，粘度低，內相很容易断裂，液滴生成速度很快，生成的乳液粒径很小，且经过搅拌易分散，粒径大小不均一(如图3a所示)；当丝素浓度为5%时，乳液成球效果好，连续相对分散相的挤压收缩作用明显，液滴均匀成球，且稳定性佳，无明显杂球产生(如图3b所示)；当丝素浓度为6%时，乳液成球效果好，但明显有尺寸不一的微球生成(如图3c所示)。

(2)表面活性剂浓度对乳液成球效果的影响

图4 不同表面活性剂浓度所制备的乳液微球光学显微镜图

表面活性剂Span-80的添加是为了防止微球在收集过程中，由于时间推移或堆叠接触时，相互之间发生融合，导致粒径增大，保证丝素微球的均一性、完整性。其基本原理是通过影响两相之间的表明张力，在二者之间形成稳定坚实的界面膜，以此来保证丝素微球的稳定性[13]。不同的表面活性剂浓度对两相之间的界面张力会产生不同的影响，因此要确定较优的表面活性剂浓度，保证成乳过程稳定进行。当丝素溶液浓度为5%时，调节表面活性剂浓度为0%、1%、2%、3%和4%，通过光学显微镜观察所形成的乳液微球形貌如图4所示。结果表明，当表面活性剂浓度较低时(0%、1%、2%)，无法在两相界面之间形成界面膜，丝素溶液成乳易塌陷，无法成球或成球后易团聚(见图4a、4b、4c)；当表面活性剂含量为3%时，如图4d所示，丝素溶液能够成乳且无聚集现象，表面活性剂在两相间形成界面膜，但不够稳定，生成的微球尺寸均匀性差；当表面活性剂含量达到4%时，能够在两相间形成稳定界面膜，乳液球形度较好，未见团聚现象(见图4e)。

2.3 工艺条件对成球粒径的影响

图5 丝素微乳液粒径尺寸随内外相流速变化关系图

通过上述研究，我们已经能够制备尺寸均一、形貌规则的丝素蛋白微球，为了对所制备的微球尺寸进行控制，需要对工艺条件进一步探讨。微球的尺寸除与内部通道的直径直接相关外，影响微球尺寸的主要因素还包括内外相的流速。研究中我们探讨了不同内外相流速对成型微球粒径的影响。首先，控制內相流速(Qd)为1mL/h，调节外相流速(Qc)分别为40、70、100、130和160mL/h。然后，控制外相流速(Qc)为100mL/h，调节內相流速(Qd)分别为0.5、0.75、1、1.25和1.5mL/h。利用光学显微镜观察生成的丝素乳液颗粒，采用Image J软件计算每组乳液中100个微颗粒的平均粒径，结果如图5所示。

从图中可以看出，当固定内相的流速时，乳液液滴的尺寸随着外相流速的增加而减小(图5a)；而当固定外相的流速时，乳液液滴的尺寸则随着内相流速的增加而增大(图5b)，这与文献报道的结果一致[14]。实验中所制备的丝素乳液液滴尺寸在150～380μm之间，经交联固化和干燥后所获得的丝素蛋白微球的尺寸会相应的缩小。

2.4 丝素蛋白微球的表征

图6 丝素蛋白微球(a)SEM图及其(b)粒径分布图

利用浓度为5%的丝素溶液，控制内相流速1mL/h，外相流速100mL/h，制得丝素微乳液，经交联固化，多次洗涤并真空干燥后得到丝素蛋白微球。所制备的微球SEM图及其粒径分布图如图6所示。从图中可以看出，丝素蛋白微球呈非常规则的球形，球体饱满，大小尺寸均一，约5.1μm。其粒径分布图也显示粒径分布峰较窄，尺寸比较集中，峰位在5.1μm，与SEM图结果一致。

3 结论

以浓度为5%的丝素水溶液为内相材料，表面活性剂Span-80浓度为4%的液体石蜡为外相，通过设计制备的同轴微流控通道能够稳定连续地制备丝素蛋白微球。通过改变内外相的流速可以调控所制备的丝素蛋白微球的粒径大小。所制备的丝素蛋白微球呈规则球形，具有很好的单分散性。

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