玉米第10染色体大刍草单片段代换系的构建及穗长QTL分析

江 院，王启亮，解新明，卢小良，张向前

(1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2.广东省草业工程技术研究中心，广东 广州 510642)

玉米是世界三大粮食作物之一，也是一种重要的饲料作物。墨西哥类玉米(ZeamexicanaSchrad.)又名大刍草，是栽培玉米(ZeamaysL.)的野生近缘种，分蘖力强，遗传稳定，具有热带种质所特有的基因，杂交亲和性好，是玉米品种选育的重要种质资源[1-4]。以墨西哥类玉米为供体，以普通玉米为受体构建染色体片段导入系组成单片段代换系(SSSLs)文库，消除遗传背景干扰[5-6]，可为玉米遗传改良提供优质种质。单片段代换系在QTL鉴定、基因精细定位、基因互作效应分析及缩短QTL研究与育种事件之间的距离等方面，均具有广阔的应用前景[7-11]，在玉米遗传育种上具有更高的实用价值和广泛的应用范围[12-13]。

在玉米染色体导入系研究方面，主要集中在玉米抗旱性、抗病性及品质改良导入系筛选[14-15]。吕香玲等[16]在近等基因导入系基础上发现了玉米抗甘蔗花叶病毒的主效QTL，为抗病育种提供了重要材料。张书红[17]构建了以优良玉米自交系87-1为遗传背景的综3导入系，鉴定并初步定位了1个新的玉米矮花叶病隐性抗病基因，其中有26个单片段导入系，覆盖率为15.70%。王帮太[18]利用构建的玉米单片段代换系进行了玉米产量相关性状的QTL鉴定。此外，单片段导入系在水稻遗传改良研究中也大量应用，日本RGP克隆的Hdl、Hd6和Hd3a等抽穗期QTL就是以水稻单片段代换系为试验材料[19-21]。有学者利用类似材料和方法，还克隆了番茄编码类胡萝卜素的等位基因和异构酶基因[22-23]。

玉米单片段代换系作为永久作图群体，是研究QTL的理想材料。在水稻、番茄、大豆、小麦等作物中单片段代换系应用研究已有大量报道[24-28]。目前，玉米的相关研究主要针对其整个染色体基因组导入系的构建及利用，系统得构建玉米某一条染色体单片段代换系的研究尚未见报道，关于穗长相关基因导入系的构建研究也相对较少。同时以墨西哥类玉米为供体构建染色体代换系亦鲜见报道。

本研究以一年生墨西哥类玉米为供体亲本，玉米优良自交系郑58为受体亲本，通过杂交、回交和SSR标记辅助选择，构建了以自交系郑58为背景的玉米第10染色体墨西哥类玉米单片段代换系群体，并对第10染色体上穗长QTL进行了初步定位。利用墨西哥类玉米的野生近缘种质构建染色体片段代换系，为玉米品种选育提供了新的育种材料，也为拓宽玉米种质遗传变异基础提供了一定支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究选用玉米自交系郑58为受体亲本，玉米野生近缘种一年生墨西哥类玉米(ZeamexicanaSchrad.)又名大刍草为供体亲本。所用BC6F1种子为郑58和墨西哥类玉米杂交F1经过多代回交得到。

1.2 试验方法

1.2.1 微卫星分子标记 采用MaizeGDB(www.maizegdb.org)公布的在玉米第10染色体上均匀分布的150对SSR分子标记作引物，对亲本进行多态性筛选。利用存在明显多态性的引物进行回交世代代换片段的检测。每对引物之间的平均距离为3.50 cM。DNA提取参照Zhang等[29]的方法。PCR反应体系参照Panaud等[30]的方法稍加修改，标记检测参照Li等[31]的方法。

1.2.2 染色体导入系群体的构建 本研究利用郑58自交系和墨西哥类玉米进行一次远缘杂交后，以郑58自交系为轮回亲本进行回交，以高代回交群体BC7F1、BC8F1和BC9F1为材料针对第10染色体进行SSR分子标记跟踪辅助选择(MAS)，构建以郑58为遗传背景的染色体单片段代换系群体。田间试验在华南农业大学增城宁西试验基地进行。具体技术路线如图1所示。

图1 以墨西哥类玉米(大刍草)为供体的玉米第10染色体单片段代换系构建图Fig.1 The procedure for constructing SSSLs on the tenth chromosome by using teosinte as donor parent

1.2.3 导入片段长度的计算 按Young等[32]提出的方法计算替换片段的长度。如图2所示，在不考虑2个相邻标记区间发生双交换的情况下，当染色体上相邻标记的基因型相同时，就认为这2个标记之间的区段由完全相同的标记基因型组成；当相邻标记的基因型不同时，就认为这2个标记基因型分别组成这个区间的一半。图2中M为分子标记，LMIN为替换片段的最小长度，LMAX为替换片段的最大长度，L为替换片段的估计长度。替换片段的估计长度等于最小长度和最大长度的平均值。本试验统一用估计长度L来度量代换片段的长度。导入片段总长度为所有导入片段长度的累加。覆盖率为墨西哥类玉米导入片段在第10染色体上覆盖的百分比。

图2 代换片段长度计算的示意图Fig.2 Schematic of donor segments length calculation

1.2.4 SSSL的穗长QTL检测 在BC9F1群体中，将含有同一个SSR标记的SSSL单株观察值作为一个群体，以10株郑58自交系单株观察值作为对照群体。通过t测验比较SSSL与郑58之间穗长的差异，以α=0.01为阈值，即P≤0.01时表示代换片段上有穗长QTL存在。

2 结果与分析

2.1 玉米自交系郑58与墨西哥类玉米之间多态性引物的筛选

在玉米第10染色体上选择分布均匀的150对SSR引物进行亲本间多态性筛选，共获得45对在供体和受体亲本间有明显多态性差异的SSR分子标记引物，平均遗传距离为12.24 cM。其中在BC7F1群体检测中选用了35对SSR分子标记引物，平均遗传距离为15.74 cM；在BC8F1群体检测中选用了40对SSR分子标记引物，平均遗传距离为13.77 cM；在BC9F1群体检测中选用了45对SSR分子标记引物，平均遗传距离为12.24 cM。各回交群体所用的引物名称及在第10染色体上的遗传距离如图3所示。

A.BC7F1群体所用引物；B.BC8F1群体所用引物；C.BC9F1群体所用引物。A.Indicates the markers using on BC7F1；B.Indicates the markers using on BC8F1；C.Indicates the markers using on BC9F1.

2.2 各回交世代单片段代换系群体的构建

2.2.1 BC7F1群体中单片段在第10染色体上的分布、长度及覆盖率 采用在2个亲本间具有多态性的SSR引物对郑58×墨西哥类玉米回交群体进行筛选，从BC1F1开始利用SSR分子标记跟踪检测，对第10染色体上的供体导入片段进行背景选择，构建回交群体。利用在2个亲本间具有多态性的35对SSR引物对BC7F1群体进行筛选，共获得72份不重复的玉米第10染色体墨西哥类玉米导入系，其中单片段代换系材料29份，代换片段长度在4.45～100.35 cM，总长度为1 101.80 cM，平均长度38.00 cM，对第10染色体的覆盖率为79.16%。最短的单片段为umc1115，其长度为4.45 cM，位于第10染色体293.40～297.85 cM；最长单片段为umc2122-umc1993-umc1196a-bnlg1839-umc2351-umc1877，其长度为 100.35 cM，位于第10染色体389.60～489.95 cM。大部分单片段代换系的长度在0～50 cM，长度较小的单片段数量居多，大于50 cM的单片段有6个。单片段代换系材料的详细资料见表1，其在染色体上的位置见图4。在BC7F1群体中所筛选的单片段在第10染色体上的分布区域为0.01～125.65 cM，172.85～322.00 cM，389.60～550.90 cM；未覆盖到的区域主要在125.65～172.85 cM和322.00～389.60 cM。未覆盖到的原因可能是在回交过程中来源于墨西哥类玉米的染色体单片段聚合在一起成为多片段没有分离，也可能是由于种植的群体过小而没有选择到该区域的单片段。

表1 从BC7F1群体获得的单片段代换系Tab.1 The SSSLs obtained from BC7F1 population cM

2.2.2 BC8F1群体中单片段在第10染色体上的分布、长度及覆盖率 采用在2个亲本间具有多态性的40对SSR引物对BC8F1回交群体进行筛选，共获得117个不重复的玉米第10染色体墨西哥类玉米导入系，其中单片段代换系材料有41份，代换片段长度在1.15～125.64 cM，总长度为1 884.74 cM，平均长度为45.97 cM，对玉米第10染色体的覆盖率为89.65%，覆盖区域为0.01～26.48 cM，180.47～300.70 cM，360.83～538.01 cM；未覆盖到的区域主要在26.48～180.47 cM，300.70～360.83 cM，538.01～550.90 cM。最短的片段为umc1873，其长度为1.15 cM，位于第10染色体246.13～247.28 cM；最长的片段为umc2399-phi118-umc1291-umc1319-bnlg1451-phi301654-umc1432，其长度为125.64 cM，位于第10染色体0.01～125.65 cM。在所有单片段中，大多数的单片段长度在0～50 cM，大于50 cM的单片段有15个。单片段代换系的详细资料见表2，其在染色体上的位置如图5所示。

图4 从BC7F1群体中获得的单片段代换系在第10染色体上的分布Fig.4 The distribution of the SSSLs obtained from BC7F1 population on the tenth chromosome

表2(续)

图5 从BC8F1群体中获得的单片段代换系在第10染色体上的分布Fig.5 The distribution of the SSSLs obtained from BC8F1 population on the tenth chromosome

2.2.3 BC9F1群体中单片段在第10染色体上的分布、长度及覆盖率 采用在2个亲本间具有多态性的45对SSR引物对BC9F1群体进行筛选，共获得69个不重复的玉米第10染色体墨西哥类玉米染色体代换系，其中单片段代换系材料有37份，代换片段长度在0.20～81.35 cM，总长度为944.15 cM，平均长度25.52 cM，对玉米第10染色体的覆盖率为70.38%。最长的片段为bnlg1360-umc1877-umc2507-umc2021-umc1038-nlg1185，其长度为81.35 cM，位于第10染色体469.55～550.90 cM，最短的片段为umc1739，其长度为0.20 cM，位于第10染色体227.95～228.15 cM。在所有单片段中，大于50 cM的单片段有3个，大多数单片段长度介于0～50 cM。覆盖区域为0.01～26.48 cM，71.85～125.65 cM，180.47～297.85 cM和360.83～550.90 cM；未覆盖到的区域主要在26.48～71.85 cM，125.65～180.47 cM和297.85～360.83 cM。未覆盖到的原因可能是在回交过程中几个染色体单片段重叠在一起没有分离，也可能是没有选择到包含该区域单片段的单株，后续检测没有明显的条带显示。单片段代换系的详细明细见表3，其在染色体上的位置分布见图6。

2.3 BC9F1群体中含有穗长QTL代换片段的筛选

通过t测验比较代换系单株与受体亲本郑58之间穗长的差异，统计测验时将含有某个SSR标记的代换系单株合并为一个群体进行统计，以10株郑58单株作为一个对照群体统计穗长观测值。当P≤0.01时，染色体片段代换系与郑58之间差异显著，表明含有某个标记的代换片段上存在穗长QTL。

试验结果表明，含有umc2528、phi054和bnlg1360标记的片段代换系与郑58之间穗长存在极显著差异，含umc1877标记的片段代换系与郑58之间穗长存在显著性差异，含umc2180标记的片段代换系与郑58之间穗长差异不显著，共计筛选到5个穗长QTL代换片段。含umc2528片段的代换系平均穗长比郑58短2.00 cm，表现为负向超亲优势；含phi054片段的代换系平均穗长比郑58短1.92 cm，表现为负向超亲优势；含bnlg1360片段的代换系平均穗长比郑58短1.89 cm，表现为负向超亲优势；含umc1877标记的代换系平均穗长比郑58短1.58 cm，表现为负向超亲优势。经t测验比较分析，穗长QTL片段代换系与受体亲本郑58穗长差异性统计结果如表4所示。由试验结果可知，筛选到的4个穗长QTL代换系相比受体亲本均表现为负向超亲优势(表4-8)。

由于BC9F1群体种植的单株数量有限，获得的单片段代换系数量不足，故在进行穗长QTL筛选时选取了含有该标记片段的所有单株合并为一个群体，进行穗长观测值统计。与郑58之间穗长存在显著性差异含有穗长QTL代换片段的株系如表5-8所示。

表3 从BC9F1群体获得的单片段代换系Tab.3 The SSSLs obtained from BC9F1 population cM

图6 从BC9F1群体中获得的单片段代换系在第10染色体上的分布Fig.6 The distribution of the SSSLs obtained from BC9F1 population on the tenth chromosome

名称Name平均穗长/cmTheaveragespikelength显著性Significance郑58Zheng5814．50±0．21umc252812．50±1．54∗∗umc218015．36±0．87nsphi05412．58±1．22∗∗bnlg136012．61±1．58∗∗umc187712．92±1．32∗

注：*表示P≤0.05;**表示P≤0.01;ns表示差异不显著。

Note：*indicatesP≤0.05;** indicatesP≤0.01;ns indicates no significant difference.

3 讨论与结论

单片段代换系是一种利用杂交、回交和分子标记辅助选择相结合构建的永久性作图群体。单片段代换系由于遗传背景单一，可用于检测微效QTL，为QTL定位及基因克隆打下基础。通过多代回交重建受体背景，以保持代换染色体不发生变化[33]。回交世代越多，受体基因纯合率越高，一般回交次数达到5代后受体基因纯合率可达75%，回交8代后能达到96.50%，可获得大量染色体代换系材料[34]。本研究以BC7F1、BC8F1、BC9F1三代回交群体为材料，连续进行SSR标记辅助选择构建染色体片段导入系，检测到大量单片段代换系，与前人研究结果相同[35-36]。此外，由于回交群体种植数量的限制，可能引起部分单片段代换系没有被检测到。

目前已构建染色体导入系群体的作物有番茄、水稻、玉米、油菜等，20世纪90年代就开始了水稻染色体导入系群体的构建[37-41]。在玉米单片段代换系构建的研究中，彭倩等[42]以自交系lx9801为受体，昌7-2为供体，用回交和SSR 分子标记相结合的方法构建了184个单片段代换系，代换片段总长为1 683.33 cM，平均长度9.25 cM，覆盖玉米基因组的35.50%。袁亮等[33]利用SSR分子标记跟踪检测BC4、BC4F1、BC4F2和BC4F3供体染色体片段，获得74个以lx9801 为遗传背景的玉米单片段代换系，片段平均长度为33.39 cM，导入片段总长为2 470.53 cM，染色体覆盖率为29%。张书红[17]以玉米自交系综3为供体，87-1为受体，利用137 个SSR 分子标记，获得84 个单片段代换系，供体片段总长度为2 056.45 cM，平均长度为24.48 cM，覆盖率为32.80%。有学者以87-1为受体亲本，综3为供体亲本，构建了大量纯合的单片段代换系[43-44]。也有研究人员通过构建玉米单片段代换系，检测出玉米开花期相关性状的QTL[45]。本研究从BC7F1、BC8F1、BC9F13个群体中共获得107个单片段代换系，片段的平均长度分别为38.00，45.97，25.52 cM，总长度为944.15～1 884.74 cM，对第10染色体覆盖率为70.38%～89.65%。长度小的单片段是研究QTL的优良材料，与前人研究结果相比较，本研究所获得的单片段长度略偏大，在染色体上覆盖率较高，其原因可能是所用的引物数量偏少，引物在第10染色体上分布密度偏低。同时，本研究所获单片段代换系均来自第10染色体，在片段数量上相比整个染色体组偏少。本研究只针对第10染色体进行单片段代换系的构建，为今后玉米第10染色体上相关性状QTL的精细定位奠定了基础。

表5 含umc2528穗长QTL片段的代换系Tab.5 Segment substitution lines of spike length QTL containing umc2528

表5(续)

表6 含phi054穗长QTL片段的代换系Tab.6 Segment substitution lines of spike length QTL containing phi054

表7 含bnlg1360穗长QTL片段的代换系Tab.7 Segment substitution lines of spike length QTL containing bnlg1360

表8 含umc1877穗长QTL片段的代换系Tab.8 Segment substitution lines of spike length QTL containing umc1877

玉米穗长性状是玉米产量的重要构成因子，一直是玉米研究的重要目标性状。为鉴定玉米穗长性状的QTL并对其进行克隆，学者们利用不同的分离群体对穗长、穗行数等穗部性状进行了大量研究，定位了部分主效QTL[46-48]。通过单片段代换系群体与受体亲本表型指标的对比，可以筛选出含有优良QTL性状的代换系材料。王帮太等[44]利用SSSLs材料对玉米穗长进行了表型鉴定，筛选到20个穗长QTL，超亲优势在-12.10%～19.18%。李卫华等[8]利用优良玉米自交系构建单片段代换系群体，通过鉴定筛选到9个穗长性状QTL。本研究从BC9F1群体中初步定位了玉米第10染色体上4个穗长的QTL，其中含umc2528、phi054、bnlg1360标记片段的代换系与受体亲本郑58之间在穗长上存在极显著差异，umc1877与郑58之间存在显著差异。4个穗长QTL均表现为负向超亲优势，相对于前人的研究，本试验获得的穗长QTL数量偏少，且没有筛选到正向超亲优势的QTL，其原因可能是BC9F1群体种植数量有限，获得的SSSLs数量较少。

回交的主要目的是恢复受体亲本的遗传背景，利用回交和分子标记辅助选择相结合的方法，可以快速建立染色体单片段代换系[49-50]。这个技术的优点是可大大缩短回交转育世代周期，最大限度地减少目标基因的遗传累赘，有效地清除非轮回亲本的遗传背景。在本研究中，使用栽培玉米作为轮回亲本导入了玉米野生近缘种的优良基因。由于野生近缘种质的丰富遗传变异性，传统作图群体如F2、DH、RIL、BC等，在后代变异中存在大量的基因分离与交换，后代的遗传背景更复杂于普通栽培玉米种内杂交或自交，因而回交是首选的育种方法之一。本研究利用连续多代回交群体进行单片段导入系的构建，随着回交代数的增加，获得的SSSLs在第10染色体基因组上的覆盖率逐渐增加，这对于进行更多目标性状QTL的鉴定和精细定位，具有重要的理论和实践价值。

构建了以玉米自交系郑58为遗传背景的墨西哥类玉米导入系群体，获得了107份单片段代换系材料。在第10染色体上筛选到4个具有负超亲优势的穗长QTL代换片段，初步定位于umc2528、phi054、bnlg1360和umc1877标记附近。今后，可通过增加染色体上引物密度，扩大世代群体种植数量，筛选出含有更多优良性状QTL的单片段代换系。

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