酶联合挤压豌豆蛋白肽的分离工艺

李慧，王琪，关健，王鑫烁，周泉城

（山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博 255049）

豌豆（Pisum sativum Linn）又名麦豌豆、寒豆、麦豆，是重要的食用和饲用豆类作物，是一种营养性食品[1]，含有的各种矿物质对人体有极大的好处，另外，国际上现研究，通过酶解所获得的豌豆蛋白肽具有一些活性功能[2]。比如，Ndiaye等[3]人研究发现豌豆酶解液具有抗氧化、降低炎症和免疫调节的作用。而Huan Li等人的研究则表明，豌豆蛋白酶解后的产物为阳离子多肽，该多肽可以有效调节Ca MK II的活性，因而可以作为保健品被利用于心血管疾病的预防方面[4]。Samson等人则发现豌豆蛋白可以抑制 ACE酶的活性，从而起到降血压的作用。

利用挤压生产的食品营养丰富、风味独特、食用方便，受到广大消费者的厚爱，也逐渐成为食品加工的重要方式[5]。挤压加工蛋白可使蛋白更易于酶解[6,7]。在挤压过程中，在温度、压力和剪切力的作用下，使维持蛋白质结构的作用力减弱，使其分子结构发生伸展，由球状转为纤维状，并使分子间氢键、二硫键等化学键断裂[8]。此外，挤压后的物料游离氨基的含量增加，使得挤出物的消化率升高，蛋白质的酶解速度加快[9]。中性蛋白酶是指最适作用pH介于6.0~7.5之间的一类蛋白酶[10]，由枯草芽孢杆菌发酵提取而得，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理[11]。其在中性pH范围内可迅速水解大分子蛋白质成肽类和部分游离氨基酸，有利于蛋白质的吸收和利用，且水解度高、风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂[12,13]。它的催化反应快，安全无工业污染[14]，被广泛用于食品的各个领域，具有很高的应用前景和研发价值。

本研究旨在以含水量为30%的豌豆蛋白为原料，采用酶联合挤压的方式对挤出物进行酶解，实验中以O自由基清除率作为抗氧化活性的评价指标，通过响应曲面实验设计优化利用中性蛋白酶酶解豌豆蛋白挤出物酶解条件并预测酶解产物自由基清除率模型，通过透析及高效液相相结合的方法进行分子的酶解产物的分离及分子量的测定。从而为豌豆蛋白酶联合挤出物的开发利用和加工拓宽思路、提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

中性蛋白酶，酶活力为47362 u/g，济宁元素高科生物科技有限公司；甲醛溶液等所用试剂均为分析纯；豌豆蛋白主要组成为水分 4.6±0.02%，蛋白质73.2±0.23%、粗脂肪0.22±0.01%、灰分4.62±0.03%，购自烟台双塔食品股份有限公司。

单螺杆挤压机，山东理工大学农业工程与食品科学学院研制，螺杆转速：170 r/min，机筒温度：60 ℃，膜孔孔径：12 mm；RE200型旋转蒸发仪，雅马拓科技贸易（上海）有限公司；FD-C10N型台式冷冻干燥机，冠森生物科技（上海）有限公司；Waters2695高效液相色谱仪，杭州赛默科技有限公司。

1.2 加酶挤压操作

称取2 kg豌豆蛋白，向其中加入2 g中性蛋白酶，混匀，调整混合物含水率为30%，过80目筛。挤压条件：机筒温度60 ℃、螺杆转速170 r/min、模孔孔径12 mm[15]。将挤出物冷却、干燥、粉碎，装袋备用，记为酶解挤出物。

1.3 豌豆蛋白挤出物的酶解

称取一定质量的样品，加入一定质量的蛋白酶和一定pH值的磷酸盐缓冲溶液，摇匀，置于恒温振荡水浴锅中，酶解3 h，沸水浴灭酶10 min。冷却后，将蛋白酶解液过滤，取滤液待测，记为酶解物[16]。

1.4 豌豆蛋白水解度的测定

采用甲醛滴定法[17]。水解度公式如下：DH%=M(V1-V2)(1000/CwoV)(1/htot)×100

其中，M为NaOH溶液的浓度（mol/L）；Cwo为所使用的豌豆蛋白质溶液的蛋白质量浓度（g/L）；V为用于甲醛滴定的酶解液的体积数（mL）；htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，豌豆蛋白为7.55。

1.5 自由基清除活性响应曲面实验设计

查阅相关资料及文献可发现加酶量、温度、pH、底物浓度为影响酶解条件的四个显著因素，因此，选择此四个因素为实验因素。通过预实验研究大致确定实验因素的用量范围，采用单因素实验确定各因素的显著变化范围，进而确定最优水平，以自由基清除率为评判指标，运用SAS 9.1软件进行实验设计分析，得出最佳的酶解条件[18]。实验因子及水平见表1。

表1 因素水平表Fig.1 Factor level table of response surface methodology

根据玄红专等人的方法[19]。

1.7 透析袋分离豌豆蛋白抗氧化肽

采用7、3.5、1 ku的透析袋，对酶解液进行依次分离。预处理好的透析袋中加入约三分之二的酶解液，两端封好，放在蒸馏水中进行搅拌，每隔一段时间换一次水，直至透出液不再有颜色变化，将透出液用旋转蒸发仪浓缩，对浓缩液进行冷冻干燥，得到豌豆蛋白抗氧化肽粉。

1.8 豌豆蛋白抗氧化肽的抗氧化活性测定

对1.7中收集得到的分子量为小于1 ku、1~3.5 ku、3.5~7 ku和大于7 ku的豌豆蛋白抗氧化肽粉进行O清除率的测定。

1.9 豌豆蛋白酶解产物分子量分布的测定

用Waters Protein-Pak 125A 300 mm×7.8 mm色谱柱对经透析袋分离后得到的分子量小于1 ku的组分进行分子量分布的分析。流动相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V），检测波长：220 nm流速：0.5 mL/min柱温：30 ℃。

1.10 数据分析

每个操作3次平行。利用SAS 9.1软件建立回归模型方程，对数据进行ANOVA分析，Duncan test确定平均值差异。

2 结果与讨论

2.1 实验原料的确定

图1 豌豆蛋白及酶联合挤压豌豆蛋白水解度Fig.1 The degree of hydrolysis of pea protein and enzymolysis combined extrusion pea protein

对原豌豆蛋白和加入中性蛋白酶挤压不同含水率的豌豆蛋白的水解度进行测定比较，得出结果如图1所示。

由图1可知，豌豆蛋白经加酶挤压后水解度明显上升，且水解度随豌豆蛋白含水量的增加呈先升高后降低的趋势，当含水量为30%时，豌豆蛋白的水解度最大，因此本实验采用含水量为30%的挤压豌豆蛋白为原料。

2.2 响应面法优化酶解物O2.-清除活性实验

查阅相关资料及文献，确定酶解时间3 h，选取加酶量（A）、温度（B）、pH值（C）、底物浓度（D）为实验因素，利用单因素实验确定各因素的最显著用量范围，进而确定最优水平，并以酶解物的 O2.-自由基清除率为评判指标[20]，设计4因素5水平共26个试验点的响应分析实验进行二次回归设计实验和分析。实验方案、实验条件及结果列于表2中。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 The response surface experiment design and results

图2 O清除率响应曲面图Fig.2 Response surface plot of the O2-.scavenging rate of pea protein enzymolysate

由表3可以得出，所建模型（p=0.0026<0.05）是显著的，失拟项（p=0.2666>0.05）是不显著的。加酶量和温度的交互项（AB）、加酶量和底物浓度的交互项（AD）、影响显著，加酶量（A）、加酶量的二次项（A2）温度的二次项（B2）、pH的二次项（C2）、底物浓度的二次项（D2）影响极显著。由F值可知，各因素对豌豆蛋白C酶解液的O2.-清除率的影响次序：pH（C）>加酶量（A）>底物浓度（D）>酶解温度（B）。根据回归方程作各因素及其交互作用对O2-.清除率影响的响应曲面图见图2。可以进一步看出加酶量、pH、温度、底物浓度，任何两因素对O2-.清除率的交互影响。其中，O2-.清除率随着各因素的升高呈现先升高后降低的趋势，说明各因素的添加量有极值点，即存在最优值，且响应曲面图在底边的投影呈圆形或椭圆形，说明四因素值选择合理[21]，验证了实验的准确性。

表3 O清除率的各因素方差分析Table 3 Variance analysis of the Oscavenging rate of pea protein enzymolysate

表3 O清除率的各因素方差分析Table 3 Variance analysis of the Oscavenging rate of pea protein enzymolysate

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F 显著性1264.34 14 90.31 5.96 0.0026 * *A 5.86 1 5.86 0.39 0.5467 B 0.02 1 0.02 1.425E-003 0.9706 C 6.41 1 6.41 0.42 0.5289 D 0.44 1 0.44 0.029 0.8674 AB 294.64 1 294.64 19.44 0.0010 * *AC 17.14 1 17.14 1.13 0.3103 AD 200.36 1 200.36 13.22 0.0039 * *BC 5.06 1 5.06 0.33 0.5749 BD 52.49 1 52.49 3.46 0.0896 CD 0.08 1 0.08 5.174E-003 0.9439 A2 397.91 1 397.91 26.26 0.0003 * *B2 301.46 1 301.46 19.89 0.0010 * *C2 500.92 1 500.92 33.06 0.0001 * *

注：*为显著（p<0.05），**为极显著（p<0.01）。

2.3 最佳自由基清除率条件

2.4 豌豆蛋白抗氧化肽的分离

对用透析袋分离得到的四个不同分子量的组分

表4 中性蛋白酶酶解豌豆蛋白酶解液的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of pea protein hydrolysate by neutral protease

2.5 豌豆蛋白酶解物小于1 ku组分的分子量分析

2.5.1 分子量标准曲线

校正曲线：Lg(MW)=7.382-0.248T，R2=0.9994，见图3.

2.5.2 分子量小于1 ku的酶解产物分子量分布图

酶解产物的分子量分布图见如图4。

图3 分子量校正曲线Fig.3 Calibration curve of molecular weight

图4 酶联合挤压豌豆蛋白酶解物分子量分布图Fig.4 Molecular weight distribution of peptide prodiucts of pea protein treated by enzymolysis combined extrusion

刁静静等[24]将豌豆蛋白的碱性蛋白酶酶解产物采用葡聚糖凝胶 G-25进行分离，得到抗氧化活性相对较高的分子量集中在470~640 u。由图3、4可知，经 1 ku透析袋分离后的酶解液，分子量大多集中在200~800 u左右，说明酶解后得到的肽大多是2~8肽，这与刁静静等的研究大致相同。

3 结论

3.1 本研究以豌豆蛋白为原料，采用响应曲面法以O2-.清除率为指标，优化中性蛋白酶酶解豌豆蛋白酶联合挤出物酶解条件，最终得出最佳酶解条件为：加酶量12.23%、温度40.23 ℃、pH 6.99、底物浓度6.92%。在此条件下，O2-.清除率为 75.93%。得到了豌豆蛋白酶联合挤出物中性蛋白酶酶解产物自由基清除预测模型，该模型预测准确可靠，可用于生产预测和工艺开发。

3.2 对酶解液进行透析分离，发现分子量小于 1 ku的酶解液抗氧化活性最强，达78.31%，其分子量集中在200~800 u左右，为2~8肽。透析能显著提高肽的抗氧化活性，得到的抗氧化活性肽具有良好的抗氧化性，能清除体内自由基、减轻自由基对机体的损伤。

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