凝胶渗透色谱净化-气相色谱-质谱法测定黄油中6种激素的残留

赵超敏，古淑青，郑江，邓晓军，岳振峰，赖富饶，闵甜，刘绍杰

（1.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135）

（2.深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

（3.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（4.山东省莘县农业局，山东聊城 252400）

性激素是甾体激素的主要组成部分，包括雄激素、雌激素和孕激素。这些物质具有强的蛋白质同化作用，畜牧业中常被用作促生长剂，以大幅度提高动物养殖经济效益[1～5]。基于对动物源性食品中激素残留风险分析的深入研究，长期摄入此类激素类药物会导致消费者内分泌紊乱和性早熟，提高致癌、致畸的风险等[6～8]。我国农业部明确规定，不得在动物源性食品中检出睾酮和雌二醇[9]。睾酮、脱氢表雄酮和雄酮是主要的雄激素；雌二醇是活性最强的雌激素，与雌酮互为前体和代谢物；孕激素主要以孕酮为主，三类激素在代谢过程可相互转化（图1）。

目前关于动物源性食品中残留激素的研究报道，主要基质是动物肌肉组织（如猪肉、牛肉和羊肉等）、肝脏、牛奶、鸡蛋和水产品等[10～13]，对黄油中激素残留的分析报道还很少。黄油因其营养价值成为人们生活中的重要食品之一，其质量安全关乎消费者的饮食健康。

黄油是高脂肪含量样品，传统的液液提取-固相萃取柱前处理净化技术难以有效去除油脂共提物，因此，本研究采用去除油脂效果良好的凝胶渗透色谱（GPC）净化技术，其根据分析物分子量大小不同而分离（色素和油脂分子量通常＞600，而激素通常＜500），可有效去除黄油中油脂和色素干扰。目前，常用的激素检测方法主要有液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）和气相色谱-质谱法（GC/MS）。虽然 GC/MS法与HPLC-MS/MS法相比需要衍生化，灵敏度稍低，但是GC/MS仍然是检测类固醇激素的强有力工具，且在确证未知类固醇激素具有其不可替代的优势[14]。因此，本文采用GPC净化技术与GC/MS相结合，同时测定黄油中6种类固醇激素，所建方法净化效果好，回收率高和重现性好，满足药物残留分析要求。

图1 6种激素的结构式Fig.1 Structure formulas of six hormones

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

6890N型气相色谱配5975型质谱仪（GC/MS），美国Agilent公司；全自动凝胶净化系统（GPC），德国LCtech公司；漩涡振荡器，德国Heidolph公司；往复式振荡器，日本 Yamato公司；全自动氮吹仪，美国Caliper公司；恒温干燥箱，德国Binder公司；低温离心机，美国Sigma公司；移液器，法国Gilson公司。

激素标准品：睾酮（T）、雄酮（A）、脱氢表雄酮（DHEA）、孕酮（P）、雌酮（E1）、17β-雌二醇（β-E）（纯度≥96.0%）均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、环己烷、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、叔丁基甲醚和吡啶（HPLC级），购自美国TEDIA公司；乙酸酐（AR级），购自广州化学试剂厂。

黄油样品：市售进口黄油。

空白样品：选择没有激素检出或含量超低水平的样品为空白样，用以制备验证用加标样品。

1.2 标准溶液的制备

储备液：分别准确称取各激素标准物质5 mg（精确至0.1 mg），以甲醇配制浓度为500.0 mg/L的单标溶液，所有溶液于棕色瓶中-30 ℃储存。

单标工作液：现用现配，使用前分别移取10.0 μL 500.0 mg/L的激素单标溶液于2 mL样品瓶中，40 ℃氮气吹干甲醇溶剂，残留物依次用100 μL乙酸酐和100 μL吡啶溶解，涡旋约1 min充分混合，于70 ℃恒温干燥箱衍生化50 min，取出冷却至室温，40 ℃下氮气吹至尽干，用环己烷定容至1 mL，供GC/MS用。

混合标准工作液：现用现配，使用前分别移取20.0 μL 500.0 mg/L的各激素单标溶液于2 mL样品瓶中，40 ℃氮气吹干甲醇溶剂，残留物依次用200 μL乙酸酐和200 μL吡啶溶解，涡旋约1 min充分混合，于70 ℃恒温干燥箱衍生化 50 min，取出冷却至室温，40 ℃下氮气吹至尽干，用环己烷定容至1 mL，并用环己烷逐级稀释成所需浓度，供GC/MS用。

1.3 仪器参数

1.3.1 GPC条件

GPC色谱柱：40010型（300 mm×20 mm，高24 cm，24 g Bio-Beads SX-2填料）；流动相：乙酸乙酯/环己烷（1:1，V/V）；流速：4.7 mL/min；定量环：5.0 mL；紫外检测波长：254 nm；柱预洗时间：0.17 min；前运行时间10.67 min；主收集时间：33 min；尾洗时间：4 min；溶剂交换周期：3次。

1.3.2 GC条件

气相色谱柱：Agilent HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样量：2 μL；进样模式：不分流；前进样口温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；MS四级杆温度：150 ℃；辅助通道温度：280 ℃；色谱柱流量：1 mL/min；色谱柱升温程序：80 ℃（保持 1 min）→15 ℃/min→250 ℃（保持 2 min）→2 ℃/min→272 ℃（保持3 min）；溶剂延迟时间：5 min。

1.3.3 MS条件

电子轰击（EI）能量：70 eV；载气：氦气（纯度99.999%）；全扫描（Scan）质量范围：50～500m/z，选择离子扫描（SIM）参数如表 1；离子驻留时间：50 ms。

表1 类固醇激素衍生物的MS采集参数Table 1 Optimized mass spectrometer parameters of steroid hormone derivatives

1.4 样品处理

称取1 g样品（精确到0.01 g）于15 mL具塞离心管中，加入5 mL乙酸乙酯/环己烷（1:1，V/V）涡旋1 min，溶解后定容至8 mL，往复振荡提取15 min，于10000 r/min下离心5 min，收集上清液至GPC样品瓶中，经GPC净化、浓缩，收集2 mL浓缩液于收集瓶中，于40 ℃下氮气吹至约0.5 mL，移入2 mL进样品中，40 ℃下氮气吹至尽干，依次用200 μL乙酸酐和200 μL吡啶溶解残留物，涡旋约1 min，于70 ℃恒温干燥箱衍生化50 min，取出冷却至室温，40 ℃下氮气吹至尽干，用200 μL环己烷定容，过0.22 μm有机滤膜，供GC/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

激素是低分子量的脂溶性物质，含量与样品脂含量成正比[15]。

黄油是高脂含量样品，提取效率的关键因素是选择合适的提取试剂和提取方法。选择具有脂溶性的丙酮、正己烷、乙酸乙酯、环己烷、叔丁基甲醚为提取试剂，结果显示，虽然5种提取试剂均可以溶解黄油，但是乙酸乙酯/环己烷（1:1，V/V）溶解效果最好，溶解液为澄清溶液，同时，乙酸乙酯/环己烷也是 GPC常用流动相，因为选择乙酸乙酯/环己烷（1:1，V/V）为提取试剂。

2.2 GPC净化条件的确定

图2 GPC前运行时间（a）和主收集时间（b）对黄油中激素加标回收率的影响Fig.2 Influences of GPC-forerun time (a) and GPC-main fraction time (b) on the recovery of hormones in butter

油脂是检测黄油中激素主要的基质共提干扰物。GPC以多孔凝胶作为固定相，分离过程，色素和油脂等大分子物质不易进入凝胶颗粒孔内而分布在颗粒间，首先洗脱下来，激素等小分子物质不仅在颗粒间隙扩散，还进入凝胶颗粒微孔中，洗脱速度慢后流出，因此，净化效果好。同时，流动相乙酸乙酯和环己烷沸点一致，一定比例混合后洗脱条件稳定。

GPC净化效果的决定因素是基质共提干扰物与目标分析物切割点的选择。当流速为4.7 mL/min时，大分子物质油脂和色素在10 min时被洗脱去除。前运行时间设计为10、10.17、10.33、10.5、10.67、10.83、11 min；主收集时间设计为16.7、20、25、33、42、50 min。由图2A可知，前运行时间为10 min时加标回收率最高，但仍有部分油脂被接收，根据除脂效果和加标回收率，前运行时间为10.67 min；图2B所示随着主收集时间的延长加标回收率逐渐增大，当主收集时间延长至50 min时，加标回收率与33 min时相差不大，为减少分析时间和节约成本，选择主收集时间为33 min。优化流速（4.3、4.5、4.7 mL/min）结果显示，相近加标回收率时，增大流速，可以大大减少样品处理时间和减少试剂消耗，流速选择4.7 mL/min。

2.3 衍生条件的选择

图3 激素的衍生化公式Fig.3 Derivatization formulas of hormones

激素具有弱挥发性和热不稳定性，含有羟基和酮基等官能团，极性较大，沸点较高，直接用 GC/MS分析灵敏度较低，且峰型差，需要衍生化转化为极性较低热稳定性好的衍生化物，以提高检测灵敏度和改善色谱峰型。常用的衍生化法主要有硅烷化法和酰化法。硅烷化法主要采用三甲基硅烷衍生化技术（TMS），同时衍生激素结构中羟基和酮基而生成烯醇化-三甲基硅烷产物（如公式 1），而酰化试剂主要是酸酐类，衍生激素结构中的羟基而生成酯类物质（如公式 2）。TMS衍生物可能会堵塞气相色谱柱末端或用于反吹的毛细管，酰化衍生物对气相色谱毛细管柱影响小，因此，试验选择常用的酰化试剂乙酸酐和催化试剂吡啶作为衍生化试剂。

通过对比不同衍生化温度（50、60、70、80、90 ℃）和衍生化时间（20、30、40、50、60 min）时目标分析物的峰面积，结果显示，随着衍生化温度和衍生化时间的延长，目标分析物的峰面积增加，当70 ℃衍生化50 min时效果最好。

2.4 质谱条件的优化

为确证目标分析物的特征离子，首先采用 Scan扫描对0.5 mg/L的激素单标衍生物进行定性分析，根据目标分析物的全质谱图，选择干扰少、选择性好的离子作为特征离子进行 SIM 扫描，以相对丰度比为100的特征离子作为定量离子，另外选取2个相对丰度较高的特征离子作为定性离子，如图4所示。

图4 激素衍生物的Scan扫描（m/z 50～500）质谱图Fig.4 Mass spectrums of hormone derivatives in full-scan mode(m/z 50～500)

2.5 色谱条件的优化

激素衍生化物极性低，应选择非极性色谱柱进行分离，HP-5MS气相色谱柱是非极性的，且具有较低的柱流失，本实验选择HP-5MS为分析色谱柱。

为使目标分析物之间和基质共提干扰物之间获得良好的分离度，对气相色谱柱升温程序进行了优化，研究发现，在气相色谱检测分析过程中，气相色谱柱程序升温速度应＜20 ℃/min，且柱温不能长时间在接近色谱柱最高温度时分析，程序升温太快或较高温度下检测分析，虽然大大缩短了分析时间且获得良好分离度，但是其基线波动大，稳定性差，并易产生大且无规律的干扰峰，导致检测灵敏度低和重复性差。经优化，建立的色谱柱升温程序为：初始温度为80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min速度升至250 ℃，保持2 min，以2 ℃/min速度升至272 ℃，保持3 min。色谱柱流量选择0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，分析结果显示在1.0 mL/min时，目标分析物分离度好。同时，经优化前进样口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，MS四级杆温度为150 ℃，辅助通道温度为280 ℃时，目标分析物灵敏度高、分离度好，色谱峰型窄而无拖尾（图5）。

图5 激素衍生物的SIM扫描总离子流色谱图（TIC）（浓度：0.5 mg/L，进样2 μL）Fig.5 Total ion current (TIC) chromatograms of hormone derivatives in selected ion monitoring (SIM) scan mode(concentration: 0.5 mg/L, injected volume: 2 μL)

2.6 线性范围和定量限

采用外标法定量。回归方程的获得是利用浓度范围为10～500 μg/kg的混合标准溶液，以浓度为横坐标（x，μg/kg）和定量离子对峰面积为纵坐标（y）进行线性回归计算，所得回归方程和相关系数见表 2，所得相关系数均大于0.999，线性关系良好。定量限根据信噪比S/N≥10确定，6种激素的LOQs为4～10 μg/kg。

表2 类固醇激素衍生物的线性方程、相关系数和LOQTable 2 Calibration equations, correlation coefficients and LOQ of steroid hormone derivatives

2.7 回收率与精密度

在空白样品中添加 10 μg/kg、50 μg/kg、200 μg/kg三个浓度水平进行回收试验，每个水平平行测定6次，结果见表 3，回收率为 77.2～112%，相对标准偏差为4.2～10%，方法的准确度和精密度符合国内外对激素残留分析的要求。

表3 空白样品中6种类固醇激素加标的回收率和精密度（n=6）Table 3 The recoveries and accuracies of 6 steroid hormones in spiked butter (n=6)

2.8 实际样品分析

采用所建方法对 4个市售黄油样品进行检测，4个样品均含有孕酮，其他激素未检出，范围为110～127 μg/kg，这与文献报道的黄油中孕酮含量值（132.9±5.1 μg/kg）相接近[16]。

3 结论

本文建立了黄油中雄酮、脱氢表雄酮、睾酮、孕酮、雌酮和17β-雌二醇的气相色谱-质谱（GC/MS）检测方法。所建凝胶渗透色谱前处理技术，操作简单、净化效果好，大大简化了高脂肪含量样品的前处理过程，提高了高脂肪含量样品中激素的提取效率，该方法准确可靠，满足高油脂样品中激素残留检测要求。

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