登革病毒复制复合体的研究进展

罗娟　郑素梅　高玉人

[摘 要]登革病毒的复制与宿主细胞膜的重建紧密相关。病毒和细胞因子产生独特的类似细胞器的结构，被称为病毒复制复合体（viral replication complex），这些病毒诱导的隔间促进了高效基因组复制，在病毒复制周期中得以使不同步骤受到精确的时空调控，并且保护病毒RNA不受宿主细胞质环境影响。综合运用超微结构解析和功能研究大大增加了我们对病毒复制复合体构建和生物起源的理解。本文将介绍登革热病毒复制复合体的形态和形成，阐述其在生物发生中所取得的进展。

[关键词]登革病毒；正链RNA；复制复合体；内陷囊泡；膜重建；脂质

[中图分类号]R373.33 [文献标识码]A

登革病毒（Dengue virus；DENV）属于黄病毒科黄病毒属，包括4个亚型：DENV1-4。它是一种蚊媒病毒，含单股正链RNA病毒，有包膜。每年大约有一亿人感染DENV，感染者症状从轻微的感冒到危及生命的登革出血热（dengue hemorrhagic fever）和登革休克综合征（dengue shock syndrome）。登革热广泛流行于东南亚、非洲、美洲、地中海中部等地区，近50年来，其发病率呈逐年上升的趋势。迄今为止，既无DENV预防疫苗问市，也没有针对性的抗病毒治疗方案应用于临床。研究病毒基因组复制的分子机制有助于病毒疫苗以及具有特异性的抗病毒药物的研发。

病毒依赖于宿主细胞代谢来扩增病毒基因组和组装传染性子代病毒。正链RNA病毒的复制发生在细胞质内或病毒诱导的类似细胞器的膜结构表面，这种膜结构可以被称为病毒复制复合体，可以有效地促进病毒复制。首先，病毒复制复合体实现了RNA翻译、复制和将病毒基因组组装成病毒粒子，旦它们之间互不干扰；第二，病毒复制复合体可以使病毒复制酶复合物的组成成分和复制需要的代谢物在一个物理空间中保持高浓度；第三，为病毒RNA提供独立于细胞质的环境是病毒复制复合体的另一个进化保守特征。在本综述中，我们重点介绍病毒复制复合体的形态，详细阐述病毒的膜重建，并讨论这些病毒破坏细胞的膜活性蛋白和脂质稳态通路在病毒复制复合体生物形成中的最新发现。

1 复制复合体的结构

由于登革病毒的体积较小，约17-25nm，病毒学的研究一直与电子显微镜的发展密切相关。DENV诱导的复制复合体是内陷囊泡或球囊类型，是从内质网衍生出来的。利用电子断层摄影技术对受DENV感染的人类肝癌细胞进行扫描，研究人员发现进入内质网腔内的是直径大约90nm的单膜囊泡而非结构化复杂膜。这些囊泡通过大约10nm的孔样通道与细胞质相连接。内陷囊泡中包含病毒复制酶和双链RNA（double strand RNA；dsRNA），而结构化复杂膜不包含dsRNA，但它们富含病毒蛋白，可能在病毒蛋白的合成或储存中发挥作用。Junjhon等在DENV感染的蚊子细胞中也观察到内陷囊泡，却没有观察到结构化复杂膜，这表明结构化复杂膜在登革复制周期中可能是一种对人细胞特异的结构。值得注意的是，DENV诱导产生的内陷囊泡与西尼罗河病毒（WNV）和蜱传脑炎病毒（TBEV）诱导的复制复合体相类似，这表明黄病毒复制复合体在生物起源和结构进化上具有保守性。

2 复制周期的时空控制

不同生物合成步骤促进病毒复制周期的时空协调。病毒由受体介导进入易感靶细胞，由低PH介导病毒包膜与细胞膜融合，核衣壳释放进入细胞质，脱壳后病毒RNA基因组转运至内质网，作为信使RNA合成病毒蛋白。病毒 RNA5端的帽子结构介导帽子依赖性RNA翻译。根据病毒多聚蛋白前体的共翻译和翻译后加工，膜结合的病毒因子和细胞因子以协调一致的方式诱导膜重排，形成病毒复制复合体。病毒的正链RNA被复制成负链RNA，负链RNA作为模板产生大量新的正链RNA，新的正链RNA又可以合成多聚蛋白或作为新负链RNA复制的模板或被组装成病毒粒子。但是RNA翻译与复制之间的转换调节机制目前还不能确定。一种可能性是将核糖体排除在病毒RNA复制的位置，另一种可能性是病毒RNA基因组环化，使翻译核糖体与病毒复制酶竞争性结合。RNA-RNA相互作用或蛋白质与病毒基因组末端的相互作用可以远程介导上述复制与翻译的拮抗作用。

3 复制复合体的病毒决定因素

病毒通过对膜脂质的局部改造或蛋白质的非对称相互作用来构建利于其复制的膜系统。非结构蛋白NS4A和NS4B在DENV 诱导的膜重建中起着重要作用。两者都有复杂的膜拓扑结构并包含中心螺旋，局部增加膜表面积，有利于诱导囊泡产生。这一过程可能是由NS4A的寡聚作用或NS4A与NS4B的相互作用维持的。但是，仅有NS4A或NS4B表达诱导产生的膜结构与DENV感染细胞所诱导的膜结构不同，说明还有额外的病毒蛋白参与了复制复合体的生成。研究发现NS1形成二聚体与膜结合并诱导膜重建，而且可能与NS4A-NS4B復合体相互作用。具有膜渗透活性的整合膜蛋白NS2A也可能参与了复制复合体的诱导，但具体机制还有待研究。除了蛋白质内在的膜活性，病毒还选择性地影响脂质和膜稳态。这些过程包括招募细胞膜形成蛋白，刺激脂质体生成，并重组细胞脂质传输系统，具体调节病毒复制复合体膜成分。

4 膜活性蛋白对复制复合体形成的作用

关于病毒如何联合选择宿主细胞蛋白用于复制复合体形成的具体机制目前仍不明确。例如：中间纤维的结构组成部分波形蛋白与DENV非结构蛋白 NS4A相互作用。由NS4A介导的波形蛋白的招募依赖于病毒RNA的有效扩增。肌动蛋白丝的聚合在DENV诱导的膜重建中起着重要的作用（与内吞作用密切相关）。但是，膜重建中波形蛋白的作用与肌动蛋白丝的作用是否类似还有待研究。

波形蛋白对复制复合体的形成有重要作用，但是缺乏其他相关细胞因子的信息，目前我们只能从诱导同一类型的复制复合体的其他正链RNA病毒中推断其作用。例如雀麦草花叶病毒（BMV），它也在内质网内腔的内陷囊泡中复制。这些囊泡的生成需要网状蛋白。内质网蛋白包括类似发夹结构的跨膜区，与高曲率的内质网小管的产生和稳定有关。BMV复制酶蛋白1a（replicase protein 1a）将网状蛋白招募到内质网膜的内陷部位，通过部分中和整体负膜曲率或稳定正膜曲率促进球形体积的扩增。网状蛋白或其他细胞膜形成蛋白是否也参与了病毒复制复合体的生物形成，这个问题仍有待研究。

5 复制复合体形成对脂质生成的影响

除了重塑现有的细胞内膜，病毒复制复合体的生成意味着细胞内膜表面的净增加，因此需要重新合成膜脂质。DENV感染细胞的高通量脂质分析显示，病毒诱导的脂质成分发生的明显变化包括主要脂质结构和信号脂类特异性的上调或下调。DENV不依赖由甾醇控制的调控元素结合蛋白（sterol regulatory element- binding protein；SREBP）介导的脂质生成，而是利用细胞内储存的脂质。DENV感染会诱发自噬介导的脂滴分解，从而释放游离脂肪酸。游离脂肪酸可用作建立病毒复制复合体的材料，或作为线粒体β氧化的能量来源。另外，DENV也会破坏脂肪酸合成酶（FAS）来刺激复制复合体的产生。FAS是一个大的含有多种酶活性的同质二聚体蛋白，用于脂质合成和细胞膜形成。非结构蛋白NS3与FAS相互作用，在复制复合体建立时招募FAS到病毒复制酶复合体上。NS3刺激FAS活性合成脂质，新合成的脂质与病毒RNA共同作用，表明在复制复合体形成过程中FAS直接参与膜的扩张。此外，西尼罗河病毒（WNV）也依赖于FAS，说明这种保守的功能在黄病毒复制复合体的生物形成中发挥了作用。

6 结论与展望

DENV基因组的复制与病毒復制复合体的形成有关，复制复合体的形成对病毒复制周期进行时空调控，确保RNA高效扩增以及必需的细胞因子保持一定的局部浓度，并保护病毒RNA不受细胞质环境影响。DENV诱导内陷囊泡或球囊类型的复制复合体，病毒内在膜蛋白的固有特性（膜活性区，不对称的形状和低聚性），有助于复制复合体的形成。DENV利用自噬从脂质中调集脂滴，同时利用脂肪酸合成酶来增加病毒诱导的细胞内膜表面积。

尽管先进的电子显微镜成像技术能在形态学细节上描述病毒复制复合体，但是它们的生物形成和共同选择的细胞因子的复杂相互作用还尚待明确。由于技术上的局限，复制复合体形成的机制并不确定，特别是关于它们生物形成早期阶段的信息是稀缺的。这些限制可以通过相关的光学和电子显微镜来克服，它们对细胞的分析具有极高的精确度。此外，病毒蛋白和RNA标记策略的技术应用于时间分辨成像，将为转运加工过程和病毒复制周期中不同的时空调控提供更详细的信息。病毒蛋白-固有膜相互作用的分子机制的描述也很少。在原生的膜环境中测定它们的三维结构，使用固态核磁共振波谱与膜模型体外研究相结合的策略将提供更深层次的解析。此外，病毒复制复合体的高通量蛋白质组学和脂质谱分析，将揭示它们的分子组成，从而扩大我们对与病毒复制复合体的生物发生和功能有关的宿主因素和途径的认识。这些方法的综合应用将揭示病毒诱导的膜结构，进一步揭示细胞膜内稳态的原理，为抗病毒治疗提供新的途径。

[参考文献]

[1] 李敏，金侠.登革病毒疫苗研究现状与展望[J].生命的化学，2014（01）.

[2] 陈世友，陈茂余，陈坚.登革热的流行病学分析及防控效果研究[J].海南医学院学报，2015（06）.

[3] 左向阳.基质金属蛋白酶3-MMP3在抗登革病毒感染中的作用及机制的研究[D].苏州大学，2014.