外源多胺促进的霍山石斛类原球茎芽发生与H₂O₂代谢的关系

杨光 罗建平 王瑛

摘要 [目的]研究外源多胺促进霍山石斛类原球茎芽的发生与过氧化氢（H2O2）代谢酶活性的关系。[方法]主要测定了外源多胺处理后H2O2的动态变化和代谢酶的活性。[结果]外源多胺在有效促进芽发生的同时也能显著提高培养物中H2O2的含量，2.0 mmol/L亚精胺（Spd）或腐胺（Put）处理5 d的培养物中H2O2含量分别比对照组高175.6%和180.6%，添加H2O2淬灭剂二甲基硫脲（DMTU）可抑制类原球茎芽的发生，补充Spd或Put可部分解除DMTU的抑制作用。在外源多胺处理前期和中期，虽然超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性无明显改变，但合成H2O2的多胺氧化酶（PAO）活性和分解H2O2的抗坏血酸过氧化物酶（APX）与过氧化氢酶（CAT）活性明显增加。[结论]外源多胺作用的霍山石斛类原球茎芽的发生与H2O2积累和分解代谢有关。

关键词 霍山石斛；外源多胺；类原球茎；芽发生；代谢酶

中图分类号 S567.2文献标识码

A文章编号 0517-6611（2018）01-0001-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the relationship between enhanced conversion of protocorm-like bodies （PLBs） of Dendrobium huoshanense to shoots by exogenous polyamines （PAs） and H2O2-metabolizing enzyme activities.[Method]We mainly measured the dynamic changes of H2O2 and the activities of metabolizing enzyme after exogenous polyamines treatment.[Result]Exogenous addition of PAs not only promoted the conversion frequency of PLBs to shoots but also elevated the levels of H2O2，compared with the control， the H2O2 levels in PAs groups increased by 175.6% （Spd） and 180.6% （Put） on the 5th day after being treated using 2.0 mmol/L Spd or Put for 5 days.Dimethylthiourea （DMTU）， the scavenger of H2O2， inhibited conversion of PLBs to shoots and the effect could be offset partly by exogenous PAs.Although the activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） did not change significantly in the early and middle stages of exogenous polyamine treatment，the activity of polyamine oxidase （PAO） for synthesizing H2O2，ascorbate peroxidase （APX） for dissolving H2O2 and catalase （CAT） were significantly increased. [Conclusion]The occurrence of protocorm buds of Dendrobium huoshanense with the action of exogenous polyamines is related to the accumulation and catabolism of H2O2.

Key words Dendrobium huoshanense； Exogenous polyamines；Protocorm-like bodies；Shoot morphogenesis；Metabolizing enzymes

多胺是生物体内广泛存在的一类具有生物活性的物质，它作为信号分子参与了植物胚胎形成、根和芽发生、花发育、果实成熟及衰老等生长发育过程，对植物的形态发生具有促进作用[1]。过氧化氢（H2O2）被认为是植物体内产生的最稳定的活性氧分子，现有研究认为它的积累与分解诱发了调控植物生长发育相关基因转录水平的改变，是影响植物生长发育的一种重要的胞内分子[2]。鉴于多胺可以通过多胺氧化酶（PAO）生成H2O2導致胞内H2O2积累并触发相关代谢酶分解H2O2[3-4]，推测多胺促进的植物形态发生可能与多胺代谢过程中H2O2的积累和分解相关。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.J.cheng）是特产于安徽霍山的名贵濒危中药材，属兰科石斛属，具有滋阴、清热、生津、润肺、止咳、明目等功效[5-6]。霍山石斛现已成功人工栽培，其种苗均是来自种子经类原球茎形态发生所形成的试管苗。笔者将从芽发生过程中H2O2代谢变化的角度探讨多胺促进霍山石斛类原球茎芽高效发生的生理生化机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料 霍山石斛类原球茎由合肥工业大学中草药与功能食品研究所提供，传代培养基为添加0.5 mg/mL NAA和0.5 mg/mL KT的固体MS培养基[7]。类原球茎（PLBs）每35 d传代培养1次。取类原球茎转接于无外源激素的固体MS培养基，在培养温度（25±2）℃、光照时间16 h/d、相对湿度80%、光照强度30 μmol/（m2·s）条件下预培养30 d作为试验材料。

1.2 外源多胺对霍山石斛类原球茎芽发生的影响 将经預培养的类原球茎分别接种于添加2.0 mmol/L亚精胺（Spd）、2.0 mmol/L腐胺（Put），以及5.0 mmol/L过氧化氢淬灭剂二甲基硫脲（DMTU）和Spd（2.0 mmol/L）或Put（2.0 mmol/L）组合的无植物激素固体MS培养基上为处理组，以不添加多胺和DMTU为对照，在培养温度（25±2）℃、相对湿度80%、光照时间16 h/d、光照强度50 μmol/（m2·s）条件下培养，分别于培养30和60 d时观察并统计芽的发生情况。芽发生频率以1 g类原球茎中产生的芽的个数表示。

1.3 H2O2含量的测定

根据Jincya等[8]的方法，通过监测过氧化物-Ti复合物在410 nm的吸光度测定培养物中H2O2水平，再根据标准曲线计算H2O2的浓度。

1.4 H2O2代谢相关酶活性的测定

多胺氧化酶（PAO）活性的测定参照汪耀富等[9]方法进行检测；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定参照Gupta等[10]和鲁萍等[11]的方法，测定SOD在光下抑制氮蓝四唑（NBT）的还原作用，以抑制NBT光化学还原50%为1个酶活单位；过氧化氢酶（CAT）活性测定参照Ayvaz等[12]的方法，在反应体系中加入50 mmol/L pH 7.0 的磷酸缓冲液、0.1 mL 3%过氧化氢和适量酶液启动反应，当反应开始后迅速测定波长240 nm处吸光度的下降速率，以1 min 1 mg蛋白分解1 μmol H2O2 为1个酶活力单位；过氧化物酶（POD）活性的测定参照Saidi等[13]的方法，用酶液启动反应并以0.25%愈创木酚和0.75%过氧化氢为底物，测定470 nm处吸光度的上升速率，以1 mg蛋白1 min氧化1 μmol 愈创木酚为1个酶活单位；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照Saidi等[13]的方法，称取0.5 g冰冻材料，研磨后于冰上加入5 mL提取缓冲液混匀提取，提取液4 ℃下离心取上清液，在25 ℃下直接测定波长290 nm处由于抗坏血酸氧化而引起吸光度的下降速率，以1 mg蛋白1 min氧化1 μmol 抗坏血酸为1个酶活单位。所有提取液的可溶性蛋白质含量按Mollavali等[14]方法测定。

1.5 数据统计处理 试验中所有处理均为随机处理，且做5～10个平行并重复3次。数据采用均值± SE表示，采用SPSS统计软件计算其显著性。

2 结果与分析

2.1 外源多胺对霍山石斛类原球茎芽发生的影响

从表1可以看出，在培养30 d时，添加2.0 mmol/L Spd或Put的MS培养基中，霍山石斛类原球茎芽发生总数分别是对照组的3.7 倍（Spd）和3.6倍（Put）；培养60 d时，多胺组芽发生总数分别是对照组的3.4 倍（Spd）和3.2 倍（Put），且多胺组大于5 mm的芽在30 d时分别占各自芽总数的23.3%和26.9%、在60 d时分别占各自芽总数的13.4%和16.3%，而对照组在30 d时无大于5 mm的芽、在60 d时占芽总数的18.0%，说明外源Spd或Put不仅能显著促进霍山石斛类原球茎芽的发生，在早期也能有效促进新生芽的生长。

进一步通过加入过氧化氢淬灭剂DMTU对外源多胺作用下H2O2水平与霍山石斛类原球茎芽发生的相关性进行了探讨，结果表明，当类原球茎在仅加入DMTU的培养基中培养30 d后，每克类原球茎芽发生总数显著降低，为对照组的44.7%，培养60 d时芽发生总数为对照组的35.8%，DMTU抑制芽发生的作用更为明显（表1、2）；当类原球茎在同时加入多胺和DMTU的培养基上培养，多胺促进的芽发生效应被显著抑制，培养30 d时每克类原球茎芽发生总数分别是仅添加Spd和Put的24.6%和22.8%且无大于5mm的芽，在培养60 d时每克类原球茎芽发生总数分别是仅添加Spd和Put的28.4%和24.5%，说明类原球茎培养早期H2O2含量的升高为芽发生所必须，H2O2参与了多胺促进的霍山石斛类原球茎芽的发生。

2.2 外源多胺促进霍山石斛类原球茎芽发生过程中H2O2含量的动态变化

为探求H2O2 与霍山石斛类原球茎芽的发生是否存在关联性，试验测定了外源多胺作用对霍山石斛类原球茎芽发生过程H2O2水平的影响。从图1 可以看出，无多胺存在的培养基中，培养物中H2O2 的含量从培养开始急剧上升，在第5天时达到高峰随后下降，并保持在一个较低的水平；在多胺组中，培养第5天的培养物中H2O2含量可高达对照组的175.6%（Spd）和180.6%（Put），并在培养第40天后与对照组H2O2含量接近，说明外源多胺对霍山石斛类原球茎芽发生早期H2O2积累的诱导作用明显，提示多胺促进的霍山石斛类原球茎芽发生与H2O2水平存在关联。

2.3 外源多胺对霍山石斛类原球茎芽发生过程中H2O2代谢酶活性的影响

2.3.1 PAO 活性。

PAO能催化多胺氧化降解产生H2O2，通过分析外源多胺作用下类原球茎芽发生过程中引起的PAO 活性变化，可揭示PAO 活性变化、H2O2的产生与芽发生三者之间的相互关系。从图2可看出，霍山石斛类原球茎芽发生过程中，对照组和多胺组中PAO 活性变化趋势相一致，在初期急剧上升，在第5天出现高峰，随后迅速下降后趋于平缓。添加外源多胺能显著提高PAO的活性，并一直维持在较高水平，多胺组在培养第5天时PAO活性分别是对照组的21.2%（Spd）和14.9%（Put），说明外源多胺明显地促进了PAO活性。PAO的活性变化与芽发生过程中H2O2积累的变化（图1）相一致，揭示霍山石斛类原球茎芽发生过程中H2O2的积累可能与外源多胺诱导的PAO活性变化有关。

2.3.2 SOD 活性。

SOD 是植物细胞中重要的清除自由基的酶类之一，其主要作用是催化

O2·-生成H2O2，并清除细胞中多余的超氧阴离子。从图3可看出，对照组和多胺组SOD活性变化情况基本一致，SOD 活性在培养前期急剧下降，最后趋于平缓，说明外源多胺对SOD 的活性影响较小，SOD对于类原球茎芽发生早期H2O2的积累无明显作用。

2.3.3 CAT 活性。

CAT作为清除H2O2的主要酶类，能将H2O2分解为H2O和O2。由图4 可见，多胺组中CAT活性变化是从培养初期开始缓慢上升，第20天达到最高后迅速下降，而对照组相对比较平缓。在整个培养过程中，多胺组CAT活性始终高于对照组，CAT活性在培养第20天的Put组和Spd组中分别是对照的1.2和1.3倍，表明外源多胺可显著提高霍山石斛类原球茎抗氧化酶CAT的催化作用，说明外源多胺在早期（5 d）通过PAO升高H2O2的含量，随后由CAT分解。

2.3.4 POD 活性。

POD是逆境条件下植物酶促防御系统的关键酶之一， 它与SOD、CAT合作将过剩的自由基去除，使体内保持正常的自由基水平。由图5 可见，外源多胺对霍山石斛类原球茎芽发生过程中POD的活性影响较小，说明类原球茎芽发生早期积累的H2O2不是由POD所降解。

2.3.5 APX 活性。APX是植物细胞中的H2O2清除酶，由图6可见，外源添加多胺明显提高APX的活性，在培养的第5天多胺组中APX活性约为对照组的13%，同时对照组和多胺组中APX活性变化趋势一致，与图1 相比，APX的活性变化与芽发生过程中H2O2 的积累趋势一致，说明APX在类原球茎芽发生早期（5 d）能快速分解大量生成的H2O2。

3 讨论与结论

研究表明，多胺调节植物生长的机制取决于多胺的合成和氧化的同时还取决于其氧化代谢过程[15-16]。 PAO是涉及多胺氧化代谢的关键酶之一，催化Spd和精胺（Spm）的次级氨基氧化产生吡咯啉、1-（3-丙氨基）吡咯啉、二氨基丙烷和H2O2 [17]。由于H2O2是PAO催化多胺氧化降解的主要产物之一，PAO活性提高，表明它有利于H2O2的積累[18]。该试验结果表明，在外源多胺作用下，不仅霍山石斛类原球茎芽发生率显著提高，而且2.0 mmol/L Spd或Put处理5 d的培养物中H2O2含量分别比对照组高175.6%和180.6%，芽发生初期PAO活性和H2O2积累也同步上升，说明多胺促进的芽发生与PAO活性升高促使H2O2积累有关，H2O2淬灭剂DMTU抑制H2O2积累和芽发生的试验结果进一步证明了H2O2积累在多胺促进霍山石斛类原球茎芽发生中的作用。

H2O2作为植物细胞中各种应激反应产生的重要信号分子，已被证明参与植物激素的信号级联及激素调控植物生长发育的信号转导[19-20]。然而，细胞中H2O2的过量对植物有毒性，但是它可以被CAT和APX分解[21]。 CAT和APX对H2O2亲和力和结合机制是不同的，CAT可以直接分解H2O2，但与H2O2的亲合力相对较弱；APX需要抗坏血酸作为底物，对H2O2具有很强的亲和力。该研究在外源多胺处理前期和中期，SOD和POD活性无明显改变，而合成H2O2的PAO活性和分解H2O2的APX与CAT活性明显增加，说明霍山石斛类原球茎在芽发生早期（5 d）由于外源多胺促进了H2O2的产生，引起细胞内H2O2的含量急速上升，为了使细胞免于毒害，APX活性急剧上升后迅速下降，而CAT活性在培养中期（20 d）时达到最高，说明APX和CAT分别在霍山石斛类原球茎芽发生的初期和中期对细胞进行解毒。在清除H2O2 毒性过程中，细胞体内氧化还原状态和与它们氧化还原反应相关的一些酶类活性水平的变化诱发了某些调控植物生长发育相关基因表达的改变[2，22-23]，从而促进了霍山石斛类原球茎的芽发生。

综上分析，外源多胺促进霍山石斛类原球茎芽发生与细胞内活性氧信号可能有关，外源多胺作用下PAO活性的升高导致了大量H2O2的产生，积累的H2O2由同步升高的APX和随后升高的CAT分解，在H2O2积累和分解过程中，细胞内的相关氧化代谢酶发生改变，可能参与了多胺促进芽发生的信号介导。

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