酶的定向进化及其应用进展

许勇

摘要 酶的定向进化是用于改良酶特性的一种策略，主要包括构建酶突变文库和高通量筛选。目前，突变文库的构建手段主要有随机突变、半理性设计和DNA改组；高通量筛选方法主要分为体内筛选和体外筛选。该文介绍易错PCR、半理性设计、DNA改组、表面展示、核糖体展示和差示荧光扫描等相关技术及其应用情况。

关键词 定向进化；易错PCR；DNA改组；高通量筛选

中图分类号 Q814 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0012-03

Abstract Direct evolution of enzyme， a strategy to improve the characteristic of enzyme， mainly included constructing enzyme mutagenesis library and highthroughput screening. At present， the main methods of constructing enzyme mutagenesis library were random mutation， semirational design and DNA shuffling；highthroughput screening can be divided into in vivo screening and in vitro screening. In this study， the related techniques and their application situation， including errorprone PCR，semirational design， DNA shuffling， surface display， ribosome display and differential scanning fluorimetry， were introduced.

Key words Direct evolution；Errorprone PCR；DNA shuffling；Highthroughput screening

酶是生物体内一种重要的催化剂，目前已发现的大多数酶的化学本质为蛋白质。由于酶在体外温和水条件下依然具有较强的催化活性，其在医药、农业、食品、化工、环境保护等领域得到广泛使用[1]。酶在实践中得到了广泛应用，但同时具有不穩定、底物单一、反应条件苛刻等缺陷，而这些主要决定于其结构和动力学等因素影响[2]。如北美萤火虫荧光素酶，其最适反应温度为23 ℃，最适反应pH 为7.8[3]，这不利于其长期保存与运输，大大限制了荧光素酶在微生物快速检测领域的应用[4]。定向进化是达尔文选择进化过程在分子水平的再现，主要通过巧妙的技术手段建立蛋白质的突变库，并从中筛选出具备改良特性的蛋白质[5]。

1 酶突变文库的构建手段

突变文库的构建手段主要有随机突变、半理性设计和DNA改组3类。

1.1 随机突变

随机突变是通过技术手段诱导目的基因发生碱基缺失、增添、替换等突变的方法构建突变文库。易错PCR是目前最常用的目的基因随机突变技术。易错PCR是通过利用低保真度TaqDNA 聚合酶和改变PCR 反应条件，如加入Mn、改变循环次数和dNTP浓度等，降低DNA 复制的保真度，在新DNA 链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA 序列变异的方法[6]。刘韩等[7]利用易错PCR 技术向羧酸酯酶基因中随机引入突变，建立酶基因突变文库，筛选出的突变菌株65产生的酶在90 ℃的半衰期提高1.2 h。Mikhail等[8]经过4轮易错PCR获得了突变酶4TS在37 ℃时的半衰期提高了158倍，但是随着温度升高这种差距明显缩小[8]。通过调整离子浓度或循环次数可以控制突变率，为防止对酶活造成破坏以及突变文库过大难以筛选，突变率不宜太高（改变1～5个碱基或1～3个氨基酸）[5]。

理论上说，随机突变应当是目的蛋白质的所有氨基酸位点都有同样可能被替换为其他19种氨基酸。但实际上，由于遗传密码的简并性、中性突变以及相邻碱基同时突变概率较低等原因，易错PCR很难做到理想化的随机突变。饱和诱变可以将蛋白质中任意位点的氨基酸诱变为其他19种氨基酸，构建突变文库。Wong等[9]于2004年首次提出序列饱和突变法（SeSaM），这是一种针对单链DNA进行突变的新技术，基本原理是在PCR扩增中，在正常dNTP中混入易被水解的α‐硫代核苷酸，得到长度不同的DNA片段库，再利用DNA末端转移酶在片段的3-末端引入通用次黄嘌呤核苷酸，最后通过片段延长、正常碱基替换构建目的基因突变文库。该法可以实现目的基因任意位点的随机突变，但在试验过程使用了多种碱基类似物和生物素化引物，并且操作过程繁琐耗时（一次完整试验需2～3 d）[1，9]。2008年，Wong等[10]在原有序列饱和突变法基础上，通过dNTP αS 、dPTP、dKTP 和 dITP等控制突变倾向，设计出了高颠换型序列饱和突变法（SeSaM-Tv+）。Acevedo等[11]利用易错PCR和饱和诱变联用的方式将一种冷活性木聚酶的T5015提高了4.3 ℃。

1.2 半理性设计

随机突变虽然效果不错，但依然存在突变文库较大、有益突变率低、筛选压力大等缺点。半理性设计是首先通过对蛋白结构信息进行分析确定影响特性的关键位点或区域，而后利用随机突变或定点饱和突变的手段改造这一关键位点或区域，从而获得有益突变株[12]。

Wang等[13]首先在野生型热稳定性醛酮还原酶Tm1743催化机制的基础上，通过分子模拟手段建立其与NADPH、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的结合模型，确定影响其对映选择性的3个关键位点Trp118、Trp86和Trp21，之后再对这3个位点分别进行饱和诱变发现Trp86 和 Trp21 2个位点突变体的对映选择性变化较大，并最终筛选出产（R）-和（S）-EHPB的最优双位点突变体W21S/W86E 和 W21L/W118H，其对映体过量值（ee value）分别为99.4% and 99.6%。

Reetz等设计的迭代饱和突变（Iterative saturation mutagenesis，ISM），依据待提高的酶学活性，选择关键的突变点或区域，进行反复饱和突变，最终筛选出目的突变株[1]。钮成拓[14]根据分子动力学模拟和定点突变结果，采用迭代饱和突变对芽孢杆菌属来源 β-葡聚糖酶中 40 位、43 位、46 位和 205 位氨基酸进行改造，通过四轮定点饱和突变，构建了7个饱和突变体文库，从中筛选得到突变体 VII（E46P/S43E/H205P/S40E），其在 70 ℃处理 1 h 后仍能保持 59.4%的剩余酶活，是野生酶经过相同处理剩余酶活的 9.43 倍。

Reetz等[15]于2005年提出的组合活性中心饱和试验（combinatorial active-site saturation test，CAST）包括2个步骤：一是在酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的并且在侧链基团取向上具有潜在的构象协同作用的2个氨基酸对作为突变位点。如果选择的氨基酸对应的位置是n，则第2个氨基酸与其空间关系上遵循以下的原则：如果第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第n+1位；若在β 折叠上，则选择第n+2位，若在310螺旋上，则选择第n+3位；若在α螺旋上，则选择第n+4位。对选取的一对氨基酸进行饱和随机突变，即这一对氨基酸要突變成20种氨基酸的任何一种。以NNK（N代表任何一种核苷酸，K代表是G或T）作为突变的碱基形式，则有（4×4×2）.2 =1 024种不同的组合，而氨基酸则可突变成20.2 =400种不同的组合。该法在特定位点上综合了理性设计和氨基酸组合随机突变的特点，产生相对较小的突变文库，减轻了筛选压力[15]。Maddock等[16]以甘油脱水酶KpGDHt的α和β亚基融合结构为对象，应用CAST突变和保守引导突变联用的方法，从5 500多个突变体中筛选出目标突变体T200S。

1.3 DNA改组

DNA改组是通过同源重组或非同源重组实现基因片段的交换重排，构建嵌合后代文库。利用不同亲本基因之间的重排将不同酶或突变酶的优良特性进行整合，获得在某一特性上的再优化或多种优良特性组合的突变酶，是一种有性改组。该法可以使多基因的有益突变进行整合构建有益突变率较高的突变库，减小了筛选压力。根据序列特点，可以分为同源依赖型和非同源依赖型。

同源依赖型DNA改组是将具有同源区段的多个亲本基因用DNase I处理成许多短小片段，再通过无引物PCR将片段延伸至完整基因长度，该法利用同源区段在退火过程中的互补结合。来自同一基因家族的基因一般都具有同源区段，以相同基因家族的不同基因（一般要求同源度>60%）为亲本基因进行DNA改组是常用的方法[5]。Rigouin等[17]在易错PCR 和CAST突变技术都失败的情况下，以相同基因家族的hASNase1基因和gpASNase1基因（同源度：75%）作为亲本基因进行DNA改组并筛选出4种Km较低的突变体，氨基酸序列分析发现重组主要发生在N-末端结构域（即催化结构域），其中有一种突变体是在催化结构域之前引入终止密码子。

易错PCR 多用于高频率诱变单个基因，与DNA改组技术联合应用可以集二者的优点，这样不仅可以对单一基因进行易错PCR 随机诱变，创造新的基因，还可以将易错PCR 获得的有益基因改组，进行序列间的重新编排，从而获得不同种、属基因家族里基因序列变异为更广、功能更强的基因。一般做法是先用易错PCR 引入点突变，构建起始基因文库，筛选出所有良性克隆，再以此作为亲本基因进行DNA 改组，使得有益突变迅速积累，基因功能明显提高。而且这样所建的突变体库小，定向进化效果显著。也可以进行多轮改组，得到更好的结果[18]。Luo等[19]利用易错PCR和DNA改组联用的方法对磷酸三酯酶进行定向进化，获得的最优突变酶活性提高了25倍，T5015达到67.6。张凯[20]通过1轮易错PCR和2种DNA改组方法联用，经过两轮高通量筛选，最终得到酶活提高2倍的突变株。因此，易错PCR 与DNA改组联合应用逐渐成为基因诱变的主要方法之一。

2 高通量筛选方法

定向进化手段改造编码酶的基因必然会有数量庞大的突变库，通过合适的筛选系统快速地从突变体文库中筛选出符合目标的蛋白质成为关键[21]。目前，采用的高通量筛选方法主要可以分为体内筛选和体外筛选2种类型[5]。体内筛选方法依赖完整的细胞结构，具有代表性的是表面展示技术，而体外筛选方法则是于胞外完成（也可利用细胞组成成分），主要包括核糖体展示技术、差示荧光扫描等。

2.1 表面展示技术

表面展示技术，是运用基因工程手段将目的基因到宿主基因组中，是目的蛋白表达并展示于宿主表面，通过亲和筛选开展综合性功能鉴定。目前常用的表面展示技术有噬菌体表面展示技术和酵母细胞表面展示技术。

2.2 核糖体展示技术

核糖体展示技术的本质是利用形成的mRNA-核糖体-蛋白质三聚体复合物，通过核糖体把新生蛋白和其mRNA 联系起来，通过删除PCR 片段的终止密码子产生真核PRM 复合物，产生的PRM 复合物随后通过抗原包被的磁珠进行捕获，mRNA 通过RT-PCR 无需解离核糖体复合物就可得到相应的DNA[22]。Skirgaila等[23]运用体外区划技术（in vitro compartmentalization，IVC）对核糖体展示技术进行改进，提出了区划核糖体展示技术（compartmentalized ribosome display，CRD）。研究者们以油包水乳液的方式对单个三聚体复合物进行区划，实现单酶分子水平的筛选，最终筛选的突变型的M-MuLV反转录酶在53～58 ℃依然可以催化合成完整长度的cDNA片段（野生型酶在48 ℃以上即无法完成）。

2.3 差示荧光扫描（differential scanning fluorimetry，DSF）

差示荧光扫描作为一种分析蛋白质热稳定性的分析手段，其方法简单，效率高。其原理是通过对样品进行缓慢地加热，在加热的过程中，检测荧光物质与结构发生改变的蛋白相结合的量，来研究蛋白质的热稳定性。朱磊[24]利用DSF法发现经过酶切破坏糖基化修饰以后，在更低的温度下就能使CTLA4.Ig的结构发生改变。DSF可以帮助评估突变蛋白的结构热稳定性，如果活性热稳定性好的蛋白，结构热稳定也好，则可以推测这种突变是通过稳定结构来提高酶的热稳定性的。

3 结论与展望

定向进化是一项体外改造酶的较为成熟的技术，已被成功用于改造酶的活性、热稳定性，底物专一性和对映选择性等[5]。构建突变文库和高通量筛选是酶定向进化不可或缺的组成部分。在构建突变文库方面还存在对突变率和突变位点的控制不足的问题，碱基偏爱性的问题依然存在，因此探索可控性更强的突变文库构建方法将是研究热点。高通量筛选方面，目前并没有一种通用的筛选方法适用于所有的改组蛋白，所以需要设计针对目的改造特征的筛选方法。要想将基因与酶的产物之间建立起直接的联系依然需要针对不同酶、不同反应和不同底物进行设计[25]。荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）近年来发展迅速，具有快速和高通量的特点，是最具潜力的高通量筛选手段之一。

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