贵州惠水县茶轮斑病病原菌的鉴定

李冬雪 赵晓珍 王勇 练珊珊 任亚峰 陈卓

摘 要 贵州省惠水县茶区常发生茶轮斑病，对茶叶品质和产量影响较大。为确定该病害的病原菌，本文对病害叶片的病原菌进行分离、纯化和培养，通过柯赫氏法则进行病原菌针刺法和剪切法的致病性测定。并依据病原菌核糖体内转录间隔区、β-微管蛋白、延伸因子-1α进行多基因系统发育分析。基于病原菌多基因系统发育和形态学结果，将病原菌确定为茶假拟盘多毛孢（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）。

关键词 茶树；茶轮斑病；假拟盘多毛孢属；形态特征；致病性分析；系统发育分析

中图分类号 S432.4+4 文献标识码 A

Abstract Tea gray blight disease always takes place in the tea area of Huishui County， Guizhou Province， which severely affects the quality and yield of tea leaves. To determine the pathogen of the disease， we isolated， purified and cultivated the pathogenic fungus from the diseased tea leaves， then determined its pathogenicity following Kochs rule with the methods of needle punch and cut. Phylogenetic analyses against multi-locus sequences， viz. rDNA-ITS， β-tublin and EF-1α were conducted. Based on the morphology and phylogenetic analyses， the pathogen was identified as Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis.

Keywords Camellia sinensis； tea gray blight disease； Pseudopestalotiopsis； morphological characteristics； pathogenicity analysis； phylogenetic analysis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.022

茶輪斑病（Tea grey blight）是一种影响茶叶产量和品质的重要病害，在世界各产茶区均有发生。1973年，该病害首次在日本鹿儿岛的茶树上发现，后将其命名为Zonate leaf spot[1]。茶轮斑病可危害茶树嫩叶、成叶和嫩茎[1]。症状特征为同心轮纹病斑，其上散生黑色小粒点[1]。成叶发病后可形成大病斑，易落叶。在日本茶区，茶轮斑病可导致茶叶减产10%～20%[2]。在南印度茶区，在危害高峰期由该病害引起的减产可达17%[3]。茶轮斑病是我国茶树的主要病害，普遍发生于浙江、安徽、福建、云南、贵州和海南等地[4]。

研究表明，茶轮斑病的病原菌存在2个优势种—茶拟盘多毛孢[Pestalotiopsis theae （Sawada） Steyaert]和P. longiseta （Speg.） K. Dai & Tak.

Kobay[5]。P. theae （Sawada） Steyaert广泛存在于印度、中国等产茶国家[3， 6]；P. longiseta （Speg.） K. Dai & Tak. Kobay主要存在于日本各茶区[7-8]。2014年，茶拟盘多毛孢被划分至假拟盘多毛孢属（Pseudopestalotiopsis），被重新命名为Ps. theae （Sawada） Maharachch.， K.D. Hyde & Crous[9]。近年来，不断有茶轮斑病病原菌鉴定的报道。例如，李应祥等[10]鉴定贵州都匀茶区茶轮斑病的病原菌为P. theae。通过对病原菌rDNA-ITS、β-tubulin和EF-1α三个基因的序列测定及比对，Chen等[11]发现重庆茶区茶轮斑病的病原菌与山茶花拟盘多毛孢菌株P. camelliae CBS 443.62和P. camelliae OP111分别有100%和99%的相似度。Zhang等[12]从云南茶轮斑病病原中发现一个新种P. furcata。Chen等[13]通过对茶轮斑病病原鉴定，发现其病原为茶假拟盘多毛孢（Ps. camelliae-sinensis）、新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）和山茶花拟盘多毛孢。因此，茶轮斑病的病原菌存在多样性，可能与地域、环境和寄主等因素相关，值得深入研究。贵州省惠水县茶区具有高温、高湿等气候特点，茶轮斑病常年发生，且危害严重。本研究针对该区域的茶轮斑病病原菌进行分离、纯化，通过形态学观察、致病性测试、以及分子生物学鉴定，确定引起该地区茶轮斑病的病原，为该病害的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离、培养和纯化

2016年10月，在贵州省惠水县七里冲茶区采集具有典型轮纹症状的茶树叶片，采用常规组织分离法，将病健交界处的叶片组织剪成约3 mm×3 mm的小叶块，先在75%酒精中浸3～4 s，然后5%次氯酸钠溶液中浸泡4～5 min，最后用无菌水洗4次，并置于已灭菌的滤纸上。待水分吸干后，置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，于25 ℃培养箱中倒置培养。长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝进行纯化。

1.2 形态学观察

将菌株GZHS-2017-01分别接种到麦芽浸粉琼脂（MEA）、PDA和燕麦片琼脂（OA）培养基上，于25 ℃恒温培养5～7 d，观察菌落形态特征。用解剖针挑取少许菌丝制片，镜下观察病原菌的

菌丝形态、产孢细胞及分生孢子。

1.3 致病性测试

分别采用针刺法和剪切法测试致病性[14]。将培养5 d后的GZHS-2017-01菌株边缘打取直径为5 mm的菌饼接种至福鼎大白茶的叶片上，用无菌脱脂棉吸附经两次灭菌的无菌水进行保湿。将枝条插入装有无菌水的锥形瓶，并套上保鲜袋，置于植物光照培养箱恒温培养。接种无菌PDA的叶片作为空白对照。培养期间，每日沿接种处剖开观察，并记录症状变化。每个处理接种10片叶片，实验重复3次。培养14 d后统计发病率及病斑大小。对病叶进行再分离，确定其与接种菌株是否一致。

1.4 分子鉴定

用手术刀片刮取在PDA上培养6 d的病原菌菌丝，用液氮研磨成粉末。采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（B518259-0050， 上海生工生物工程股份有限公司）提取病原菌DNA。采用rDNA-ITS、β-tub和EF-1α 基因对Pseudopes-talo- tiopsis属真菌进行分子生物学鉴定[15]。采用White等[16]报道的通用引物（ITS4和ITS5）进行rDNA-ITS基因扩增。根据GenBank中已报道的β-tub（JQ683711.1）和EF-1α（JQ683743.1）基因序列设计引物（表1），由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用HS Taq酶试剂（Ex Taq Hot Start Version， 大连TaKaRa）进行PCR扩增。采用切胶纯化回收试剂盒（E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit， 美国OMEGA bio-tek公司）纯化PCR产物；采用pGEM?-T Easy Vector System I（Promega公司， 美国）连接纯化PCR产物至T载体，转化Trans1-T1感受态细胞（TransGen Biotech公司， 北京），挑取阳性克隆，委托上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。测序结果提交至Bankit，获得基因登录号。结合EF-1α序列NCBI-blast在线比对的结果，选择参比序列。利用DNAMAN 8.0软件进行拼接及序列多重比对。采用PAUP v 4.0b10 （Swofford 2003）及最大简约法（Maximum Parsimony， MP）进行聚类分析及进化树构建，rDNA-ITS、β-tub和EF-1α基因的系统发育树分析方法选择Bootstrap，重复次数（replication）为1 000，最大的树数目（Maxtree）设置为10 000。小于50的自展值在发育树上不体现。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与纯化

从有典型轮纹症状的茶树叶片分离纯化出15个菌株，其中，疑似茶假拟盘多毛孢Ps. camelliae-sinensis的菌株最多，共12个，比例约为80.0%。同时，观察发现分离获得的12个疑似茶假拟盘多毛孢菌株在分生孢子、菌丝和菌落形态上均一致。选择菌株GZHS-2017-01为代表菌株进行深入研究。

2.2 病原菌形态学鉴定

病原菌在3种培养基上的生长速度由快至慢依次为MEA>PDA>OA。在MEA培养基上，菌落呈同心圆状，边缘平整，背面中间部呈橙色，边缘为淡黄色，菌丝浓密，呈白色绒状图（图1-A）。PDA培养基上，菌落呈纹状，边缘稍有不规则，背面呈淡黄色，菌丝为白色或无色（图1-B）。OA培养基上，菌落呈波浪状，边缘不规则，正面为白色，背面由中心至边缘颜色由浅棕色渐变至白色，菌丝呈白色（图1-C）。

产孢细胞在产孢初期较长，直立或微弯曲，细胞游离的一端略尖、中间略宽，无色（图2-A）；中期变为啤酒瓶状，有较短的附属丝，无明显分隔，细胞无色或者淡色（图2-B）；后期呈纺锤形，出现明显分隔，细胞着棕色，附属丝变长（图2-C）。分生孢子大小为（24～30） μm×（6～9） μm，纺锤形，直向略弯，具有4个隔膜5个细胞；两端细胞细，细胞顶端有2～3根（主要有3根）无色附属丝；少数有1或4根，长度为16～38 μm。附属丝顶端略膨大；尾端有一根基部附属丝，长度为2～ 11 μm。分生孢子初期无色，后期顶端细胞无色，圆柱形或锥形，长3～5.5 μm；中央3个细胞长15.5～21 μm，均变为褐色，颜色深浅基本相同。隔膜颜色较着色细胞颜色更深，近黑色；基部细胞透明，倒锥形，长3.5～6 μm（图2-D～G）。

2.3 病原菌的致病性测定

茶树叶片经针刺法和剪切法接种菌株GZHS- 2017-01后均可产生病斑。接种4 d就可见较为明显的病斑，在伤口处呈棕黄色，边缘为浅黑色（图3-A2、B2）。当时间延长至14 d，2种处理的病斑都不断扩大（图3-A3、B3）。比较接种不同时间的病斑，发现接种后第4 d如果不产生病斑，后期基本不产生病斑。提示接种早期对病原成功侵染较为关键，我们推测菌饼与叶片伤口贴合不好，或者菌丝活力不够，导致菌丝未能成功侵染。随后因为寄主对剪切或针刺伤口的响应反应，在针刺或剪切部位所形成的防御效应，菌丝就更难以侵染。

我们对针刺和剪切处理14 d的发病率和病斑大小進行统计，表明剪切处理的侵染率比针刺处理高，但后期2种处理的病斑大小差异不大（表2）。试验发现针刺法和剪切法对照无病斑产生（图3-A1、B1）。

接种至茶叶上病斑初期为棕黄色，后期病斑不断扩展，中间变为浅棕黄色，边缘黑色面积扩大，见有少数凸起的浓黑色小粒点，与田间症状类似（图4）。进一步对病斑中的病原菌进行分离培养及分子鉴定，结果表明与接种菌一致。

2.4 病原菌分子生物学鉴定

在获得rDNA-ITS（MG744351）、β-tub（MG744352）和EF-1α（MG744353）的基因登录号后，序列比对发现菌株GZHS-2017-01与Ps. camelliae-sinensis的模式菌株（LC3490）在3个基因上序列相似性非常高。我们采用3个基因（rDNA-ITS+β-tub+EF-1α）加合的方法进行系统学分析。3个基因加合总长度为1740个位点（rDNA-ITS： 1-498， β-tub： 499-842， EF-1α： 843-1470）。其中，简约信息位点93个，可变非简约信息位点164个，并采用PAUP v 4.0b10（Swofford 2003）软件构建进化树。运行结果显示获得1个进化树（TL=289， CI=0.93， RI=0.87， RC=0.81， HI=0.07）（图5）。系统学的分析将GZHS-2017-01与模式菌株（LC3490）归为一个分支（自举支持率为81%）。

3 讨论

本研究从贵州惠水茶轮斑病的病害样品中分离获得与GZHS-2017-01高度相似的多个菌株，根据柯赫氏法则，确认其为茶轮斑病的致病菌。基于3个基因序列构建的系统发育树初步确定致病菌GZHS-2017-01为茶假拟盘多毛孢（Ps. camelliae-sinensis）。

拟盘多毛孢属真菌的传统分类方法有限，主要依据于植物寄主和孢子的形态特征。随着分子系统发育树在拟盘多毛孢属真菌分类中的应用，Maharachchikumbura等[9]依据rDNA-ITS、β-tub和EF-1α基因序列对拟盘多毛孢属的分类进行了修订，并从此属中划分出了新拟盘多毛孢和假拟盘多毛孢2个属。假拟盘多毛孢属进一步划分出Ps. camelliae、Ps. cocos、Ps. ignota、Ps. indica、Ps. kubahensis、Ps. simitheae和Ps. Theae 7个种[17]。近年来，我国广西、浙江、云南等地茶树上陆续发现茶假拟盘多毛孢的危害[15]。通过比较GZHS- 2017-01与Ps. camelliae-sinensis F. Liu & L. Cai sp. nov.的形态，我们发现二者间在菌落和分生孢子有很多相似之处。

因此，结合分子生物学鉴定结果及形态学特征，我们确定贵州惠水茶区茶轮斑病的病原菌GZHS-2017-01为茶假拟盘多毛孢。

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