SAT技术检测结核杆菌rRNA对肺结核的快速诊断价值

许蕴怡 蔡杏珊 谭耀驹 刘燕文 曾少芳 马品云 周辉林

广州市胸科医院检验科（广州 510095）

中国的结核病流行趋势令人关注。目前能否提供敏感、快速的抗结核疗效指标指导临床应用，至关重要。目前，结核病的实验室检查中的涂片荧光染色镜检法及快速培养法（Bactec MGIT960）仍然是确诊肺结核的传统方法，临床监测疗效可通过以下指标来考察：（1）2个月直接涂片阴转率：现常用于结核病的控制指标，但耗时长，其在国内阳性率总体不高，仅为10%～30%［1］，敏感度低；（2）快速培养法（Bactec MGIT960）比前者优越，但检测周期长，时间滞后于用药，而限制其临床应用；而两者阳性者均难以鉴别结核及非结核杆菌，前者不能区分死活菌。

近年来，分子技术在国内外发展以及临床广泛应用，以RNA为靶标的诊断技术可以反映病原体的存活状态，用于疗效监测。SAT⁃TB技术是以MTB特异的16srRNA为靶标实时检测，从而快速测出样本中是否有活MTB存在。本研究通过SAT⁃TB技术对结核病患者的痰、支冲液标本进行检测来判断MTB的活菌是否存在，评价其对肺结核病的快速诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选则广州市胸科医院收集2015年9月22日至11月22日广州市胸科医院疑似肺结核患者痰液169份、支冲液151份，共计320份标本；同时进行SAT法、快速培养法（Bactec MGIT960）检测。

1.2 主要试剂与仪器 试剂：结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（上海仁度生物科技公司，批号20150925）；荧光涂片法染色液及快速液体法培养液均由我院检验科自配；仪器：美国应用公司ABI7300荧光定量扩增仪；BACTEC MGIT960仪器。

1.3 方法

1.3.1 标本预处理 提取约2 mL左右的标本至50 mL离心管中，加1～2倍的2%N⁃乙酰半胱氨酸-氢氧化钠前处理液（去污染），漩涡震荡20 s，静置15 min后，以3 200 r/min离心15 min，弃去上清，加入1 mL/管PBS缓冲液（pH=6.8）以中和PH至6.8，混匀备用。

1.3.2 SAT⁃TB检测 取液化好的痰标本1 mL于EP管中，以13 000 r/min离心5 min，后弃上清，再加入1 mL PBS缓冲液重悬离心，弃上清。将痰液标本加入50 μL裂解液重悬，该样品即为待测样本，用超声破碎仪破碎15 min，功率300 W。后将2 μL处理物加入含30 μL扩增检测液的洁净微量反应管或者反应板中。置恒温荧光检测仪上进行检测。

1.3.3 快速液体培养法（Bactec MGIT960） 提取约2 mL左右的标本至50 mL离心管中，加1～2倍的2%N⁃乙酰半胱氨酸-氢氧化钠前处理液（去污染），漩涡震荡20 s，静置15 min后，以3 200 r/min离心15 min，弃去上清，加入1 mL/管PBS缓冲液（pH=6.8）以中和PH至6.8，取液化后的痰标本放入BACTEC MGIT960仪器检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。分别以快速液体培养法和临床诊断为“金标准”，计算SAT检测的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值，突出比较BD960快速液体培养法和SAT法在痰液、支冲液的阳性检出率，“率”用卡方检验比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 广州市胸科医院疑似肺结核患者的痰液169份、支冲液151份，共计320份标本进入最后研究。169例痰液标本患者中，男122例，女47例。痰液标本菌鉴结果为非结核分枝杆菌患者有8例，其中龟-脓肿分枝杆菌复合群3例，胞内分枝杆菌5例，3例非结核分枝杆菌感染患者的培养为阳性且SAT⁃TB为阴性。151例支冲液标本患者中，男97例，女54例。支冲标本菌鉴结果为非结核分枝杆菌患者有6例，其中龟-脓肿分支杆菌复合群3例，堪萨斯分枝杆菌2例，鸟-土分枝杆菌1例，2例非结核分枝杆菌感染患者的培养为阳性且SAT⁃TB为阴性。见表1、2。

表1 169例疑似肺结核患者痰液的BD960法与SAT法实验结果Tab.1 The result of 169 sputum suspected MTB patients of BD960 and SAT⁃TB 例

表2 151例疑似肺结核患者支冲液的BD960法与SAT⁃TB法实验结果Tab.2 The result of 151 BALF suspected MTB patients of BD960 and SAT⁃TB 例

2.2 以培养法为标准，SAT⁃TB检测痰液、支冲液诊断肺结核的价值 BD960快培法在痰液、支冲液的阳性检出率分别为：29.58%（50/169）和23.18%（35/151）；SAT⁃TB法在痰液、支冲液的阳性检出率36.09%（61/169）和39.07%（59/151）。痰、支冲液两者的阳性率比较：痰SAT法阳性检出率较BD960快速培养法高6.51%，（χ2=59.34，P＜ 0.05）；支冲液SAT法阳性检出率较BD960快速培养法高15.89%，（χ2=36.69，P＜0.05），差异均有统计学意义。SAT⁃TB检测痰液、支冲液对肺结核患者的诊断价值见表3、4。

表3 SAT⁃TB检测痰液对肺结核患者的诊断价值Tab.3 The diagnostic value of testing sputum MTB patients by SAT⁃TB

表4 SAT⁃TB检测支冲液对肺结核患者的诊断价值Tab.4 The diagnostic value of testing BALF MTB patients by SAT⁃TB

2.3 以临床诊断为标准，SAT⁃TB检测痰液、支冲液诊断肺结核的价值 若以临床诊断作为判断肺结核为阳性标准，临床诊断肺结核包括培阳及培阴肺结核，临床诊断非肺结核或疑似肺结核为阴性标准，SAT法在痰液、支冲液标本对肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为：57.73%（56/97）、93.06%（67/72）、91.80%（56/61）、62.04%（67/108）；51.82%（57/110）、94.29%（39/41）、96.61%（57/59）、42.39%（39/92）；BD960法在痰液、支冲液标本的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为：51.55%（50/97）、95.83%（69/72）、94.34%（50/53）、59.48%（69/116）；33.64%（37/110）、90.24%（37/41）、90.24%（37/41）、33.64%（37/110）。

3 讨论

多种结核杆菌的快速诊断方法均已建立，主要以DNA或者RNA作为检测靶标的分子生物学技术，有噬菌体快速诊断法、基因芯片法［2-4］等。目前，一种以RNA为标本类型的检测手段受到人们的关注，其原理是以MTB特异的16srRNA为检测目标，通过实时荧光定量PCR技术，快速判断MTB是否存在［5］，又可反映是否存在活菌，优于直接涂片荧光法和BD960法，与前者比较，操作时间从1 d缩短到1.5 ～ 2 h［6］；与后者比较，SAT⁃TB法检测痰液/支冲液操作完成总共时间平均为1.5～2 h，BD960快培法平均报阳时间约为14～21 d，检测时间上优于BD960法［6-10］。

现在常用荧光探针定量PCR技术与SAT⁃TB技术相比，均具有快速的优点。前者扩增产物为DNA无法做活菌诊断，更不能反映活菌的量，无法监测患者的用药疗效，不利于临床调整用药方案。并且DNA也较易在实验室中产生污染；后者则可弥补其不足。

本研究结果显示：BD960快培法和SAT法在痰液、支冲液的阳性检出率分别为：29.58%（50/169）和 23.18%（35/151）、36.09%（61/169）和37.75%（57/151）。痰标本两者的阳性率比较，SAT⁃TB法阳性检出率较BD960快速培养法高6.51%，差异有统计学意义（χ2=59.34，P＜ 0.05）；支冲液两者的阳性率比较，SAT阳性检出率较BD960快速培养法高15.89%，“率”之间的比较，差异存在统计学意义（χ2=36.69，P＜0.05）。SAT法在痰液、支冲液标本的敏感度分别为：84%（42/50）；89%（33/37）。用 LE PALUD 等［11］用 Xpert Mtb/RIF检测BALF对培阳标本的敏感度为80%，特异度为98.6%；其他方法如KIM等［12］研究巢式PCR法诊断结核病的敏感度仅为69.4%。以IS6110为基础的环介导恒温扩增法（LAMP）［13］检测呼吸道标本诊断肺结核的敏感度可达89.6%。因此，与其他最新使用的分子生物学诊断技术比较，SAT⁃TB法检测BALF诊断结核病的敏感度与最新使用的其他分子生物学技术Xpert Mtb/RIF相似，比经典PCR法敏感度高。所以，SAT⁃TB法检测支冲液能提供较高的敏感度和特异度。

此外，在痰、支冲液中SAT⁃TB法检测结果与BD960法的一致率达81.66%、76.16%，也就是说SAT⁃TB法能够在最短的时间内提供准确率为81.66%或76.16%的诊断结果；SAT法在痰液、支冲液的阳性检出率36.09%、39.07%略高于BD960快培法29.58%、23.18%。

从数据中却不难发现，50例痰培阳标本中有8例SAT⁃TB法阴性，37例痰培阳标本中有4例SAT⁃TB阴性，说明产生假阴性结果，与BD960快速培养法比较痰、支冲液的SAT⁃TB法的检出率分别为84%、89%，而非100%，而痰中14例、支冲液中24例却被SAT⁃TB法检出阳性。因此，若以临床诊断肺结核为计算肺结核阳性标准，临床上仍有约10%～20%的培阳患者无法通过SAT⁃TB法检出，但结果证明SAT⁃TB法对肺结核的检出率略高于BD960快速培养法。两者存在各自的优点，究其原因可能有：（1）SAT⁃TB法的靶标为RNA，它降解的速度快，对于菌量未足的标本会因处理时间过长，RNA降解后而不被检出，这与操作者控制试验的时间至关重要。而BD960快速培养法中不存在RNA降解的问题，只是在固定时间范围内达到一定的菌量即可在液体培养基生长。因此，因不同操作者而得出的不同的阳性检出率。（2）当患者可能是结核杆菌与非结核杆菌感染混合感染时，会干扰SAT⁃TB法对结核杆菌的检出，而培养法可以为阳性。因此，BD960快速培养法与SAT⁃TB法可以同时用于临床辅助诊断，但本研究证明：SAT⁃TB法检测痰液和支冲液标本中的结核分枝杆菌，具有快速、敏感度高、特异度和阳性率较好的优点，可区分结核和非结核杆菌。因此，SAT⁃TB法为一项有价值的辅助临床诊断的工具之一。

综上所述，该技术的今后临床使用中，若能增加患者的标本量或在用药的不同时段增加该项目的检测，对药物治疗的跟踪监测具有非常重要的意义，这是单纯依靠BD960快速培养法在此方面是无法比拟的；若能把SAT⁃TB法联合BD960法一起使用，可能会进一步提高检测的敏感度。因此，SAT⁃TB法技术在临床上是值得广泛推广应用的。

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