HLA-G5慢病毒过表达载体构建和鉴定及对人羊膜间充质干细胞的感染效率分析

宫黎明，周满红，廖富团，徐绍华，罗克燕，董世桃，程宇凌，杨智敏

(1.遵义医学院附属医院 生殖医学中心，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 急诊科，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院附属医院 体检中心，贵州 遵义 563099)

人类白细胞抗原G(human leucocyte antigen-G,HLA-G)是非经典的HLA-I类分子，其编码基因及分子结构与经典HLA-I类分子相似。1987年首次报道HLA-G，现已知7个亚型中，1-4亚型是膜结合型蛋白，5-7 亚型是可溶性蛋白。HLA-G5和部分HLA-G1膜外可溶性片段组成可溶性HLA-G(sHLA-G)[1-2]。近年研究发现sHLA-G的检测有可能成为生殖医学实验室胚胎选择的无创性指标。HLA-G5具有诱导免疫耐受作用，因此在移植免疫、肿瘤免疫和生殖免疫领域备受关注，具有广泛的基础研究和临床应用前景[3-5]。

人羊膜间充质干细胞(human amnion drived mesenchymal stem cells，hAD-MSCs)易获得，无侵入性，伦理问题少，具有低免疫原性和扩增能力强等优势，近来引起国内外学者研究热潮。其多向分化潜能及诱导免疫耐受的能力更是受到普遍关注[6-8]。MSCs在体内外一定条件下可以适量分泌HLA-G5[9]，我们将完整HLA-G5基因转入真核表达载体，构建高效感染的慢病毒包装系统，并感染hAD-MSCs，用于后续探讨HLA-G5在hAD-MSCs体内外诱导免疫耐受中的作用和机制，或HLA-G5修饰的hAD-MSCs直接移植治疗疾病模型，并探索将hAD-MSCs作为细胞反应器制备HLA-G5的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 经知情同意后，无菌采集遵义医学院附属医院产科足月剖宫产胎盘，剥离羊膜后按先前的实验程序分离人羊膜间充质干细胞[6]。pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供，质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司，基因合成和载体链接由苏州金唯智生物科技有限公司完成。基因测序由华大基因公司完成。MTS试剂购自Promega公司。ELISA试剂盒购自江苏科特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HLA-G5的合成 按文献报道[10]，HLA-G5是由HLA-G外显子1-4，加上之后紧接的一段内含子4，其翻译终止于内含子中的终止密码子。检索GenBank中HLA-G基因CDS中外显子1-4加第四内含子序列得到HLA-G5序列，采用人工基因合成的方法合成HLA-G5基因片段，将基因通过5' EcoRI 和 3' NotI位点克隆至载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒(Ampicillin)。然后转化至 DH5α 大肠杆菌中，将构建好的pCDH-CMV-HLA-G5-EF1-copGFP过表达质粒进行超纯抽提，并进行酶切鉴定和测序比对。

1.2.2 HLA-G5慢病毒的包装 选择处于对数生长期的293T细胞，按比例配制过表达pCDH-CMV-HLA-G5-EF1-copGFP质粒和3个包装质粒及钙转试剂的混合液，然后轻轻加入2×HBSS中，混匀后轻轻滴入293T细胞中。转染12～18 h后，更换新的培养基，感染后48 h收集细胞上清，离心，分装，-80 ℃保存。感染后72 h再收集一次细胞上清，方法同上。

1.2.3 慢病毒感染hAD-MSCs效率 按照慢病毒母液浓度的4%、8%、20%和100%感染hAD-MSCs，NC为慢病毒浓度0%的对照组，感染48 h后DAPI复染细胞核，荧光显微镜下，初步观察感染效率，胞浆为GFP绿色荧光的细胞即可判为HLA-G5阳性细胞，胞核为DAPI蓝色荧光的细胞为总细胞数，二者比值(×100%)即为感染效率。

1.2.4 慢病毒连续感染24 h后细胞毒性检测 MTS法检测慢病毒连续感染hAD-MSCs后24 h的毒性。取对数生长期hAD-MSCs进行细胞计数，调整细胞浓度，96孔板中每孔加100 μL细胞溶液中约含1×103个细胞。慢病毒按上述不同浓度梯度感染hAD-MSCs，分组同上，每个浓度设置3个复孔。培养24 h后，每孔加入20 μL MTS溶液，低速摇床摇10 min，继续培养3 h，终止培养，使用酶标仪测定每孔在490 nm波长处的吸光光度值(OD值)，并根据公式：细胞活力=(慢病毒感染OD值-调零孔OD值)/(NC组OD值-调零孔OD值)×100%，计算各组细胞活力。

1.2.5 感染后ELISA检测HLA-G5蛋白表达效率 慢病毒感染60 h后，ELISA法检测上清液中的HLA-G5变化情况。按试剂盒步骤将标准品和稀释液按一定比例稀释，450nm波长测各孔吸光度(OD值)，根据标准物浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品OD值代入方程式，计算出所测上清液中的HLA-G5浓度，再乘以稀释倍数，本实验中稀释倍数为5倍。每个样品设置3个复孔，空白孔不加样品和酶标试剂，样品孔和标准孔OD值均以空白孔调零。

2 结果

2.1 HLA-G5表达载体的酶切鉴定和测序结果

2.1.1 过表达质粒进行超纯抽提后经酶切鉴定 pCDH-CMV-HLA-G5-EF1-copGFP经EcoRI和NotI酶切后变为载体pCDH-CMV-EF1-copGFP和目的基因HLA-G5条带，大小分别为7 521 bp和980 bp(见图1)。

1：没有消化酶切电泳条带；2：EcoRI 和 NotI酶切消化后电泳条带；3：Ladder。图1 酶切鉴定质粒琼脂糖电泳图谱

2.1.2 测序结果 序列比对与设计序列符合率100%，HLA-G5过表达质粒质量合格(见图2)。HLA-G5基因序列为：ATGGTGGTCATGGCGC CCCGAACCCTCTTCCTGCTGCTCTCGGGGGCCCTGA CCCTGACCGAGACCTGGGCGGGCTCCCACTCCATG AGGTATTTCAGCGCCGCCGTGTCCCGGCCCGGCCG CGGGGAGCCCCGCTTCATCGCCATGGGCTACGTGG ACGACACGCAGTTCGTGCGGTTCGACAGCGACTCG GCGTGTCCGAGGATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGGT GGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAAGAGGAG ACACGGAACACCAAGGCCCACGCACAGACTGACA GAATGAACCTGCAGACCCTGCGCGGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCAGTTCTCACACCCTCCAGTGGATGATTGGCTGCGACCTGGGGTCCGACGGACGCCTCCTCCGCGGGTATGAACAGTATGCCTACGATGGCAAGGATTACCTCGCCCTGAACGAGGACCTGCGCTCCTGGACCGAGCGGACACTGCGGCTCAGATCTCCAAGCGCAAGTGTGAGGCGGCCAATGTGGCTGAACAAAGGAGAGCCTACCTGGAGGGCACGTGCGTGGAGTGGCTCCACAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGATGCTGCAGCGCGCGGACCCCCCCAAG ACACACGTGACCCACCACCCTGTCTTTGACTATGA GGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACC CTGCGGAGATCATACTGACCTGGCAGCGGGATGG GGAGGACCAGACCCAGGACGTGGAGCTCGTGGAG ACCAGGCCTGCAGGGGATGGAACCTTCCAGAAGT GGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAGGAGCAG AGATACACGTGCCATGTGCAGCATGAGGGGCTGCC GGAGCCCCTCATGCTGAGATGGAGTAAGGAGGGA GATGGAGGCATCATGTCTGTTAGGGAAAGCAGGA GCCTCTCTGAAGACCTTTAA。

2.2 hAD-MSCs感染效率 自主构建慢病毒pCDH-CMV-HLA-G5-EF1-copGFP，感染hAD-MSCs后48 h DAPI复染细胞核，通过倒置荧光显微镜观察胞浆绿色荧光阳性细胞数占胞核蓝色荧光总细胞数的比例变化。各浓度病毒感染hAD-MSCs后36 h胞浆即有绿色荧光，且随病毒感染浓度增高，绿色荧光增强，此后绿色荧光蛋白持续表达，细胞形态无明显变化。感染后48 h，胞浆绿色荧光蛋白强度增高，病毒浓度20%以上感染时，感染效率接近100%(见图3)。

测序图所示为HLA-G5基因序列中的部分碱基序列，详细测序结果略。图2 质粒测序结果(部分)

A、B、C、D和E分别为浓度0%、4%、8%、20%和100%慢病毒母液感染后绿色荧光蛋白表达和DAPI复染情况(比例尺为200 μm)，F为A～E各组感染效率量化图(GFP阳性细胞数占DAPI总细胞数的百分比)。图3 慢病毒感染48h后感染效果(A～E)和感染效率(F)

2.3 MTS检测病毒连续感染24 h对hAD-MSCs的毒性 因为病毒的毒性，一般慢病毒感染时间为8～16 h，不会超过24 h，我们连续感染24 h，观察到慢病毒毒性较小，连续感染24 h显微镜下未发现细胞有明显死亡情况，对慢病毒连续感染24 h后MTS检测OD值发现，100%病毒感染时其OD值较NC组有显著性差异(P<0.01)，其他浓度组与NC组均无显著差异(P>0.05)。当病毒浓度小于或等于纯病毒液浓度20%时，细胞活力均在85%以上，即使100%病毒液感染时，细胞活力也接近70%(见图4)。

A：慢病毒连续感染24 h后MTS法检测490 nm处吸光度值(**：P<0.01；ns：差异不具有统计学意义)；B：根据公式计算出每组细胞活力。图4 慢病毒毒性检测和细胞活力分析

2.4 ELISA检测上清液中HLA-G5表达 根据试剂盒标准曲线和稀释倍数，计算出各组中HLA-G5的浓度，发现未感染慢病毒载体时，hAD-MSCs即有适量HLA-G5表达，慢病毒pCDH-CMV-HLA-G5-EF1-copGFP感染hAD-MSCs后60 h，其上清液中HLA-G5表达明显升高，与未感染慢病毒的NC组相比均有显著性差异(见图5)。

*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。 图5 慢病毒感染60 h后hAD-MSCs上清液中HLA-G5表达量

3 讨论

HLA-G的全长基因由6个外显子组成，外显子 1编码前导肽，外显子2、3、4分别编码α1、α2和α3结构域，外显子5和6分别编码跨膜区和胞质区。HLA-G5是HLA-G全长基因外显子1-4再加内含子4翻译的结果，翻译过程终止于此区域终止密码子处，导致外显子 5和 6不翻译，跨膜区和胞质区缺失[2,10]。在HLA-G分子3个可溶型亚型中，HLA-G5表达量比其他亚型丰富，功能研究最为明确[9]。既往研究HLA-G5时多数只克隆HLA-G α1、α2、α3结构域的cDNA序列，忽略了第四内含子65个核苷酸的序列[11-12]。我们采用人工基因合成(未加Flag)经酶切鉴定和测序得到正确的序列，为后续更为客观准确地研究HLA-G5的功能奠定基础。

慢病毒载体可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞，包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞等难以感染的细胞。慢病毒感染真核细胞避免了原核表达包涵体的形成和翻译的蛋白不能完全执行生物学功能的问题[13-14]。hAD-MSCs属于较难感染的干细胞[15-16]，本实验构建的慢病毒重组载体感染hAD-MSCs后具有低毒高安全性和高感染效率等优点。由于HLA-G5是分泌型蛋白，只有分泌到胞外才能发挥其更大功能，因此我们未检测mRNA水平和胞内蛋白表达水平而直接检测了感染慢病毒后的细胞上清，并检测到了高浓度HLA-G5的表达，成功建立了HLA-G5基因修饰的hAD-MSCs细胞稳株，为进一步研究HLA-G5在hAD-MSCs体内外诱导免疫耐受中的作用和机制，研究HLA-G5修饰的hAD-MSCs直接移植治疗临床疾病，并探索将hAD-MSCs作为细胞反应器制备HLA-G5的可行性提供前期实验基础。

后续免疫效应和机制的研究及如何获取高纯度的HLA-G5蛋白是今后工作的难点，有待于我们在今后的工作中进一步探索。

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