60Co-γ射线对小菜蛾遗传不育的影响

罗玲艳，张晓锋，魏香琴，张 珂，翁群芳

(华南农业大学 昆虫毒理研究室,天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广东 广州 510642)

小菜蛾(Plutellaxyllostella(Linnaeus))属鳞翅目菜蛾科,是一种世界性害虫，主要危害十字花科植物，据估计全球每年用于防治小菜蛾的费用为10亿美元[1]。长期以来，人们主要使用各种杀虫剂来防治小菜蛾，随着杀虫剂的频繁不合理使用，不仅使小菜蛾对杀虫剂产生了不同程度的抗性，而且严重污染了环境进而危害到人类的健康[2]。昆虫辐照不育技术(Sterile insect technique,SIT)是一种无污染、环境友好型害虫防治技术，也是替代化学农药防治害虫的一种很有前景的技术[3]。经过几十年的发展，昆虫辐照不育技术已在棉铃虫(Helicoverpazea)[4]、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)[5]、舞毒蛾(Lymantriadispar)[6]等鳞翅目害虫的防治实践中取得成功，并已发展成为害虫综合治理工程的重要措施。

遗传不育技术(IS)是昆虫不育技术的衍生技术，其利用亚不育剂量处理过的雄虫与可育雌虫进行交配，之后的F1代和F2代种群数量将有所减少，并且F1代中大部分是生殖能力低下的雄虫。North[7]通过对早期遗传不育方面研究的综述，讨论了IS在鳞翅目害虫种群控制方面的潜在优势及可能遗传基础。有研究表明，长期室内饲养的辐照昆虫，由于人工选择和近亲繁殖，其飞行能力、寿命和交配竞争力会受到显著影响，相对于野外昆虫而言，辐照昆虫对野外环境的适应能力会有所下降[8]。如在同等辐照剂量下，人工饲养的墨西哥按实蝇(Anastrephaludens(Loew))雄虫进行交配的机会显著少于野外种群[9]。Omar等[10]对小菜蛾雄虫进行辐照，得出最佳亚不育剂量为150～200 Gy。Hoa等[11]用200 Gy剂量辐照小菜蛾6日龄蛹，并与小菜蛾绒茧蜂(Cediaplutellae(Kurdjumov)(Hymanunoptera：Braconidae))共同进行放飞试验，观察F1代的遗传不育及对田间种群的抑制情况，结果显示F1代小菜蛾种群减少40%，F2代减少90%。参考Omar等[10]的报道，本实验室预试验分别用150，200和250 Gy60Co-γ辐照小菜蛾，证实200 Gy为处理小菜蛾雄虫不育的最佳亚不育剂量。本研究用最佳亚不育剂量200 Gy辐照小菜蛾6日龄蛹，并通过蛹的羽化率及辐照雄虫的飞行能力、交配能力、生殖能力、对雌虫性信息素的感知能力、寿命等一系列参数来观察辐照雄虫的质量，从而为在田间运用遗传不育技术防治小菜蛾提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试小菜蛾(Plutellaxylostella)采自华南农业大学农场，实验室内用未喷洒过农药的芥蓝苗(BrassicaalboglabraL.H.Bailey)对小菜蛾幼虫进行饲养，成虫在养虫笼(45 cm×45 cm×50 cm)中以10%蜂蜜水作为营养液进行饲养。芥蓝苗和养虫笼都置于培养箱中，培养箱条件为温度(25±1) ℃，相对湿度60%～70%，光照时间14～16 h/d，光照强度1 000～4 000 lx。当小菜蛾4龄幼虫准备化蛹时，用0号毛笔收集并放置于培养皿里，记录化蛹的时间，雌蛹和雄蛹在第4龄阶段分开饲养。

1.2 辐照源

加拿大渥太华Nordion公司设计的60Co-γ辐照源，辐照剂量率为16.67 Gy/min，用Fricke剂量计校准(ISO/ASTME 1026-04)， 辐照设施位于广东省广州市南沙区辐锐高能技术有限公司。

1.3 辐 照

收集大小一致的小菜蛾6日龄雌蛹、雄蛹，分别置于直径3.5 cm的培养皿中，带到广东省广州市南沙区辐锐高能技术有限公司用200 Gy60Co-γ进行辐照，对照组不进行辐照，每处理3个重复。

1.4 测定指标及测定方法

1.4.1 雌蛹和雄蛹的羽化情况 将辐照组和对照组各50头雌蛹、雄蛹带回实验室，分别放置于养虫笼(45 cm×45 cm×50 cm)中，每天观察记录蛹的羽化数，连续记录10 d, 计算羽化率。

羽化率=(羽化成虫总数/辐照蛹总数)×100%。

1.4.2 雄虫对雌虫性信息素的感知能力 利用小菜蛾性诱剂LPS-YBQ003(类似雌虫性信息素的特殊仿生化合物,泉州市绿普森生物科技有限公司)，测定雄虫对雌虫性信息素的感知能力。200 Gy处理12 h后，将羽化的350头雄虫用绿色荧光粉标记，对照组雄虫用红色荧光粉标记，同时释放到3 m3纱笼中，每个笼子中放置4盆芥蓝，紧贴芥蓝苗处悬挂带有粘板的船型诱捕器，诱芯每天换1次，每隔12 h记录1次捕捉到的小菜蛾数量，直至养虫笼中无飞行成虫，每处理3个重复。

1.4.3 飞行能力的测试 小菜蛾的飞行能力运用生物测试法[12]测定，即将辐照组与对照组的蛹分别放置在养虫笼(45 cm×45 cm×50 cm)中，每个笼子中悬挂1个直径10 cm、高15 cm的塑料透明无底圆筒，圆筒横向悬挂，内侧撒上滑石粉以防止成虫爬出圆筒，在圆筒的中间放置50头蛹，羽化的成虫只能飞出圆筒，每隔12 h记录飞出的成虫数量，连续记录并计算雄虫飞出率，直至活蛹全部羽化。

雄虫飞出率=(飞出圆筒的雄虫总数/雄虫总数)×100%。

1.4.4 成虫交配行为与能力 按UM×UF、IM×UF、UM×IF、IM×IF(其中UF、UM分别表示未辐照雌虫和雄虫，IF、IM分别表示已辐照的雌虫和雄虫)模式两两配对形成4种组合，每组合3个重复，每重复20对成虫。将配对好的成虫单独放置于贴有透明薄膜纸、大小为500 mL的罐头瓶内，瓶中放有10%的蜂蜜水供成虫补充营养。昼夜观察交尾情况，晚上在红外灯下观察，发现交尾后记录时间，等交尾结束后，IM×UF组撤出雌虫，换入未经辐照的刚羽化的雌虫；UM×IF组撤出雄虫，换入未经辐照的刚羽化的雄虫；UM×UF组撤出雌虫，换入未经辐照的刚羽化的雌虫；IF×IM组，无需换出雌虫或雄虫。每隔30 min观察成虫的交配行为，连续观察记录，直至成虫自然死亡，同时计算交配率[13-14]。

交配率=(总交配对数/处理总对数)×100%。

1.4.5 成虫的寿命 将辐照组和对照组的雌雄蛹，单独放置于直径3 cm、长度10 cm的试管内。试管中固定1根细长的棉花棒，将棉花棒浸透10%蜂蜜水以供成虫取食。3个重复，每重复20对试虫，观察记录蛹羽化的时刻，每隔24 h观察成虫的存活情况，连续观察，直至成虫自然死亡。

1.5 F1代、F2代遗传不育的表现

将小菜蛾蛹按UM×UF、IM×UF、UM×IF和IM×IF进行配对，分别置于养虫笼中，其中UM×UF为对照组，每处理3个重复，每重复F1代以亲代羽化的成虫数量为准，F2代各选取10对，进行繁殖力、生育能力、羽化率、性别比例(雄虫数量/雌虫数量)和存活时间评估。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2010和DPS 9.5 软件进行处理，采用邓肯氏(Duncan’s)新复极差检验法进行完全随机单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 辐照对小菜蛾亲代的影响

2.1.1 小菜蛾蛹羽化率和成虫寿命 由表1可知，经200 Gy辐照处理，小菜蛾雄蛹的羽化率为60%，羽化后的雄虫寿命为8.83 d，雌蛹的羽化率为52.67%，羽化后雌虫寿命为7.90 d，无论是羽化率还是成虫寿命，辐照组与对照组相比均显著降低，且辐照雌虫的羽化率和成虫寿命均低于辐照雄虫。由此可见，辐照降低了蛹的羽化率，缩短了成虫的寿命，且雌虫比雄虫对辐照更为敏感。

表1 辐照对小菜蛾蛹羽化率、成虫寿命以及雄虫不育质量的影响Table 1 Effects of irradiation on eclosion rate of pupa,adult life and male sterility quality

注：表中数据为“平均值±标准误”；同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Note:Data are “ME±SE”;Different lowercase in each column indicate significant difference atP<0.05 level.The same below.

2.1.2 雄虫对雌虫性信息素的感知能力 雄虫对雌虫性信息素感知能力的测试结果显示，船型诱捕器粘贴板上捕获的辐照雄虫有182.33头，对照组有183.33头，可见与对照组相比，辐照雄虫对雌虫性信息素的感知能力无显著差异。

2.1.3 雄虫飞行能力 由表1可知，辐照雄虫飞出率为91.08%，与对照组相比无显著差异。由此说明，200 Gy辐照对雄虫的飞行能力无显著影响。

2.1.4 雄虫交配能力 由表2可知，在观察的20对交配小菜蛾中，对照组 UM×UF组合的交配对数和交配率分别为14.67和73.33%，IM×UF组合的交配对数和交配率分别为14.67和73.33%, UM×IF组合的交配对数和交配率分别为14.33和71.67%，IM×IF组合的交配对数和交配率分别为14.00和71.67%，各配对组合之间的交配对数和交配率均无显著差异。由此说明，200 Gy剂量辐照对雄虫的交配能力未产生显著影响。

表2 辐照对雄虫交配能力的影响Table 2 Effects of irradiation on mating capability and behavior of Plutella xylostella

2.2 辐照对小菜蛾当代成虫产卵量和F1代的影响

2.2.1 当代成虫产卵量和F1代性别比例 由图1可知，UM×UF、IM×UF、UM×IF、IM×IF 4组配对组合的单雌产卵量存在显著差异，其中UM×UF组合的单雌产卵量最多，为23.24粒；其次为IM×UF组合，单雌产卵量为16.34粒； IM×IF组合的单雌产卵量最少，仅为5.33粒。可见，UM×UF、IM×UF、UM×IF、IM×IF 4组配对组合单雌产卵量依次减少，且差异显著。由此说明，小菜蛾雌虫较雄虫对辐照更敏感，且辐照能降低当代成虫的产卵量。

柱形图上标不同小写字母表示同一指标相比差异显著(P<0.05)。下图同Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level. The same below图1 辐照对小菜蛾当代成虫产卵量和F1代性别比例的影响Fig.1 Effects of irradiation on fecundity of parents and sex ratio of F1 generation

由图1还可知， UM×UF、IM×UF、UM×IF、IM×IF 4组配对组合F1代的性别比例(雄虫/雌虫)依次为1.01,1.54,1.27和1.17。其中组合IM×UF与对照组合UM×UF相比差异显著，UM×IF、IM×IF组合与对照组合UM×UF相比有一定差异，而UM×IF和IM×IF组合间无显著差异。可见，组合IM×UF的性别比例最大且显著大于对照组，表明F1代种群中雄虫偏多。

2.2.2 F1代卵孵化率 由图2可知，UM×UF、IM×UF、UM×IF、IM×IF 4组配对组合的孵化率分别为94.83%，75.93%，86.88%和64.15%，卵的孵化率以UM×UF、UM×IF、IM×UF、IM×IF组合依次降低，且彼此间差异显著。由此可见， 辐照能显著降低F1代卵的孵化率。

图2 辐照对小菜蛾F1代卵孵化率和化蛹率的影响Fig.2 Effects of irradiation on hatchability and pupation rate of F1 generation

2.2.3 F1代化蛹率 由图2可知，UM×UF、IM×UF、UM×IF、IM×IF 4组配对组合的化蛹率分别为82.52%，44.11%，21.83%和10.35%，可见4组配对组合F1代的化蛹率依次降低且差异显著。由此可知，辐照能显著降低F1代的化蛹率。

2.3 辐照对小菜蛾F1代产卵量和F2代化蛹率的影响

由图3可知，200 Gy辐照小菜蛾6日龄蛹，按UM×UF、IM×UF、UM×IF、IM×IF进行配对组合后，UM×UF组合F1代的单雌产卵量为16.97粒，F2代化蛹率为72.02%；IM×UF组合F1代雄虫和F1代雌虫与正常成虫分别交叉交配后，F1单雌产卵量分别为9.23和11.23粒，F2代的化蛹率分别为41.4%和39.64%；UM×IF组合F1代雄虫和F1代雌虫与正常成虫分别交叉交配后，F1单雌产卵量分别为6.83和5.77粒，F2代的化蛹率分别为36.82%和34.38%；IM×IF组合F1代单雌产卵量为2.32粒，F2代的化蛹率为34.98%。由此可见，与对照组合UM×UF相比，各处理组合无论是F1代单雌产卵量还是F2代的化蛹率均显著降低；辐照处理组合中，与UM×UF组合相比，UM×IF和IM×IF组合F1代的单雌产卵量和F2代化蛹率也显著降低。

1，6分别表示为UM×UF组合和IM×IF组合；2,3分别表示为P代IM×UF组合下的F1代IM×UF组合和UM×IF组合；4,5分别表示为P代UM×IF组合下的F1代IM×UF组合和UM×IF组合1 and 6 indicate UM×UF and IM×IF,respectively;2 and 3 indicate F1 generation IM×UF and UM×IF of the parents IM×UF,respectively；4 and 5 indicate the F1 generation IM×UF and UM×IF of parents UM×IF,respectively图3 辐照对小菜蛾F1代产卵量和F2代化蛹率的影响Fig.3 Effects of irradiation on fecundity of F1 generation and pupation rate of F2 generation

3 讨论与结论

因独特的遗传组成，低剂量辐照可导致鳞翅目昆虫后代高度不育，这是遗传不育技术(IS)的典型特点[12]。国内外对于IS机理的研究主要集中在生殖细胞方面，生殖细胞较体细胞对辐射更为敏感，用一定剂量射线辐照昆虫后，昆虫体细胞结构的破坏可能不是很明显，以至于辐照后昆虫还能存活并能正常保持飞行、交配等行为，但生殖细胞结构受到严重破坏，当部分不育雄虫同野生雌虫交配时，破坏作用通过F1代遗传给后代，导致产卵量和卵的孵化率降低、孵化后代高度不育且雄性数量占有绝对优势[15-16]。

本研究结果证实，辐照组小菜蛾F1代单雌产卵量、卵孵化率、化蛹率以及F2代单雌产卵量均显著低于对照组。F1代的性别比例受辐照影响明显，无论处理亲代是雄虫还是雌虫，其F1代的性别均偏向雄性，而对照组F1代基本保持典型的1∶1 性别比，在F1代中性别比偏向雄性的转变是对辐照不育的典型响应[17]。在IS应用中，F1代在田间产卵并发育，因此与野生小菜蛾在相同的生存环境下竞争，且F1代性别以雄性偏多，通过向种群中增加更多雄虫或者更少雌虫破坏了野生蛾亲代典型的1∶1性别比例，更有助于提高遗传不育技术对小菜蛾的防治效果。本研究结果表明，辐照雄虫的飞行能力与交配能力以及对雌虫性信息素的感知能力并未与对照组产生显著差异，而在行为表现上也有证据证明用低剂量辐照昆虫进行遗传不育干预，并不会影响雄虫的交配能力及其对雌虫性信息素的感知能力，如Ocampo[18]证实，100 Gy 辐照棉铃虫(Helicoverpaarmigera)雄蛹，并不影响其交配能力和交配倾向力。

用相对低剂量辐照雄虫和雌虫来比较其后代的不育程度，在仙人掌蛾(Cactoblastiscactorum)[12]上已有研究。关于遗传不育技术对降低辐照昆虫F2代种群不育潜力的影响，Steinitz等[19]在葡萄花翅小卷蛾(Lobesiabotrana)的相关研究中发现，其种群的减少具有剂量依赖性，但对于辐照雄虫的后代而言，辐照雌虫后代的减少并不明显；辐照雄虫后,遗传不育的影响主要体现在F2代中;而辐照雌虫遗传不育的影响主要表现在F1代的成虫数量上，继而使F2代的种群更小。本研究结果与此类似，用200 Gy辐照小菜蛾6日龄蛹，辐照当代的单雌产卵量及F1代单雌产卵量、卵孵化率、化蛹率等均显著降低，表明辐照昆虫的F1代和F2代种群都受到了抑制。在辐照对雄虫不育质量能力的影响方面，本研究表明，辐照雄虫对雌虫性激素的感知能力及成虫的飞行能力、交配能力均无明显影响，但繁殖能力显著降低，寿命缩短，这一系列参数有效验证了IS防治小菜蛾的可行性。

[参考文献]

[1] Talekar N S,Shelton A M.Biology,ecology,and management of the diamondback moth [J].Annual Review of Entomology,1993,38(1):275-301.

[2] Hemingway J,Ranson H.Insecticide resistance in insect vectors of human disease [J].Annual Review of Entomology,2000,45(1):371-391.

[3] Boshra S A,Mikhaiel A A.Effect of gamma irradiation on pupal stage ofEphestiacalidella(Guenée) [J].Journal of Stored Products Research,2006,42(4):457-467.

[4] Carpenter J E,Gross H R.Suppression of feralHelicoverpazea(Lepidoptera:Noctuidae) populations following the infusion of inherited sterility from released substerile males [J].Environmental Entomology,1993,22(5):1084-1091.

[5] North D T,Holt G G.Population suppression by transmission of inherited sterility to progeny of irradiated cabbage loopers,Trichoplusiani[J].The Canadian Entomologist,1969,101(5):513-520.

[6] Mastro V C.Gypsy moth F1sterility programme:current status [C]//Radiation induced F1sterility in Lepidoptera for Areawide Control.Vienna,Austria:IAEA/FAO,1993:125-129.

[7] North D T.Inherited sterility in Lepidoptera [J].Annual Review of Entomology,1975,20(1):167-182.

[8] Arakaki N,Nagayama A,Kishita M,et al.Influence of irradiation on dispersal ability and survival rate in the sugarcane click beetleMelanotusokinawensishira (Coleoptera:Elateridae) [J].Applied Entomology and Zoology,2010,45(2):303-311.

[9] Rull J,Brunel O,Mendez M.Mass rearing history negatively affects mating success of maleAnastrephaludens(Diptera:Tephritidae) reared for sterile insect technique programs [J].Journal of Economic Entomology,2005,98(5):1510-1516.

[10] Omar D,Mansor M.Effect of substerilization doses of radiation on the biology of diamondback moth [C]// Radiation Induced F1Sterility in Lepidoptera for Area-Wide Control.Vienna,Austria:IAEA,1993:3-9.

[11] Hoa N T Q,Tien N T T.Radiation induced F1sterility inPlutellaxylostella(Lepidoptera:Plutellidae): potential for population suppression in the field [J].Florida Entomologist,2001,84(2):199-208.

[12] Carpenter J E,Bloem S,Bloem K A.Inherited sterility inCactoblastiscactorum(Lepidoptera:Pyralidae) [J].Florida Entomologist,2001,84(4):537-542.

[13] 谭永安，祝树德，柏立新，等.小菜蛾交配行为及能力的观察 [J].江苏农业学报，2011,27(4):746-749.

Tan Y A,Zhu S D,Bai L X,et al.Mating capability and behavior ofPlutellaxylostella[J].Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,2011,27(4):746-749.

[14] 闫喜中，孙学俊，邓彩萍，等.日龄和温度对小菜蛾交配行为的影响 [J].山西农业科学，2014,42(8):829-831.

Yan X Z, Sun X J,Deng C P,et al.Effects of age and temperature on the mating behaviors ofPlutellaxylostella(Lepidoptera:Plutellidae) [J].Shanxi Agricultural Sciences,2014,42(8):829-831.

[15] Cáceres C,McInnis D,Shelly T,et al.Quality management systems for fruit fly (Diptera:Tephritidae) sterile insect technique [J].Florida Entomologist,2007,90(1):1-9.

[16] Triseleva T A,Safonkin A F.Effect of ionizing radiation on oocyte development and reproductive activity inArchipsPodanascop(Lepidoptera,Tortricidae) [J].Biology Bulletin,2009,36(5):505-509.

[17] Cagnotti C L,Viscarret M M,Riquelme M B,et al.Effects of X-rays onTutaabsolutafor use in inherited sterility programmes [J].Journal of Pest Science,2012,85(4):413-421.

[18] Ocampo V R.Effect of a substerilizing dose of radiation on the mating competitiveness of male and on the mating propensity of femaleHelicoverpaarmigera(Lepidoptera;Noctuidae) [J].Florida Entomologist,2001,84(2):194-198.

[19] Steinitz H,Sadeh A,Kliot A,et al.Effects of radiation on inherited sterility in the European grapevine moth (Lobesiabotrana) [J].Pest Management Science,2015,71(1):24-31.