金属离子对香菇纤维素酶、漆酶和木质素过氧化物酶活性的影响*

肖冬来，张 迪，林衍铨，杨 菁

（福建省农业科学院食用菌研究所，福建 福州 350014）

香菇（Lentinula edodes）是世界第二大宗食用菌，其产量仅次于双孢蘑菇（Agaricus bisporus），而我国是香菇生产第一大国。香菇具有抗肿瘤、预防心血管疾病、免疫增强等功效[1－3]，是具有极高应用价值的食（药）用菌之一。香菇属于木腐菌中的白腐菌，通过分解腐木中的木质纤维素为其生长提供营养成分。参与木质素降解的过氧化物酶主要有木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，纤维素降解酶系主要包括羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶和β－葡萄糖苷酶。目前，对香菇胞外酶活性、不同时期胞外酶的表达动态的研究较多[4－5]，而金属离子对香菇胞外酶活性影响的研究相对较少[6－7]。为此本文分析了6种常见金属离子对香菇羧甲基纤维素酶、漆酶和木质素过氧化物酶活性的影响，为通过添加金属离子提高香菇胞外酶活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试的香菇菌株L236为福建省农业科学院食用菌研究所保藏。

1.2 主要试剂与仪器

3，5-二硝基水杨酸（DNS）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）、二铵盐（ABTS）、亚甲基蓝、96孔板，购自上海生工生物技术有限公司。氯化钾、氯化钠、无水氯化钙、七水硫酸亚铁、一水硫酸锰、六水氯化镁等，均为国产分析纯。Biotek Epoch 2型微孔板分光光度计，购自美国伯腾仪器有限公司。

1.3 菌丝培养

香菇菌丝培养基配方：木屑80%、麸皮18%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%。菌包在23℃下黑暗培养30 d，菌丝生长至满袋。

1.4 粗酶液制备和相对酶活比较

取菌丝培养物50 g，加入250 mL去离子水，放置于4℃冰箱浸提16 h，用4层纱布过滤后，滤液于4℃、3 000 g离心15 min，所得上清即为粗酶液。在粗酶液中分别添加不同浓度的Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+金属离子，室温放置30 min后用于酶活测定。设定未添加金属离子的酶活性为100%，加入金属离子的酶活性折算成相对酶活，比较金属离子对酶活性的影响，每个处理重复3次取平均值。

1.5 羧甲基纤维素酶活性测定

取 400 μL 用 pH 4.6、0.1 mol·L-1醋酸盐缓冲液配制的0.5%羧甲基纤维素钠、粗酶液100 μL（添加不同浓度的金属离子），混匀后45℃水浴1 h，然后立即加入375 μL DNS溶液沸水浴10 min，冷却后加入去离子水稀释10倍，取200 μL利用微孔板分光光度计检测520 nm处的吸光值。以沸水浴灭活的添加不同浓度金属离子粗酶液作对照，用吸光值的变化来表示酶活性的变化。

1.6 漆酶活性测定

取 500 μL 用 pH 4.0，0.2 mol·L-1醋酸盐缓冲液配制的0.5 mmol·L-1ABTS溶液、粗酶液500 μL（添加不同浓度的金属离子），混匀后30℃反应3 min，取200 μL利用微孔板分光光度计检测420 nm处的吸光值。以沸水浴灭活的添加不同浓度金属离子粗酶液作为对照，用吸光值的变化来表示酶活性的变化。

1.7 木质素过氧化物酶活性测定

木质素过氧化物酶的测定参考祝子坪等[8]的方法，取200 μL反应液利用微孔板分光光度计检测664 nm处的吸光值。以去离子水代替H2O2的反应体系作为对照，用吸光值的变化来表示酶活性的变化。

2 结果与分析

2.1 6种金属离子对香菇羧甲基纤维素酶的影响

不同浓度金属离子对羧甲基纤维素酶的影响见图1。

图1 不同浓度金属离子对羧甲基纤维素酶的影响Fig.1 Influence of different metal ions on carboxymethyl cellulase activity

从图1中可以看出，相比不添加金属离子的空白对照 CK，Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+对香菇羧甲基纤维素酶具有不同的激活效果，其中Na+、Ca2+、Fe2+对羧甲基纤维素酶激活效果较小，仅1 mmol·L-1Fe2+时最大可提升约10%。K+激活作用最明显，在1 mmol·L-1时酶活性提高了53%，其次为10 mmol·L-1Mg2+和 10 mmol·L-1Mn2+，分别可提高酶活性43%和31%。

2.2 6种金属离子对香菇漆酶的影响

不同浓度金属离子对漆酶的影响见图2。

图2 不同浓度金属离子对漆酶的影响Fig.2 Influence of different metal ions on laccase activity

从图2中可以看出，不同浓度的Fe2+对漆酶活性均具有显著的抑制作用。较高浓度（10 mmol·L-1和5 mmol·L-1）的Na+、K+、Ca2+也可抑制漆酶活性，1 mmol·L-1和 0.5 mmol·L-1时对酶活性影响不明显。Mn2+和Mg2+在4个浓度下，对漆酶活性的影响均不明显。

2.3 6种金属离子对香菇木质素过氧化物酶的影响

不同浓度金属离子对木质素过氧化物酶的影响见图3。

图3 不同浓度金属离子对木质素过氧化物酶的影响Fig.3 Influence of different metal ions on lignin peroxidase activity

从图3中可以看出，Na+在10 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时，对木质素过氧化物酶具有激活作用，分别可提高酶活性56%和42%。而不同浓度的K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+，对香菇木质素过氧化物酶均具有抑制作用。

3 结论与讨论

Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+对香菇羧甲基纤维素酶具有不同的激活作用，其中K+、Mn2+和Mg2+激活效果较显著。金属离子对纤维素酶的影响往往因纤维素酶的不同来源而产生差异，如Mn2+对绿色木酶（Trichoderma viride）纤维素酶具有抑制作用[9]，而对饲用纤维素酶却具有较强的激活作用[10]。Fe2+可抑制漆酶活性，Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+对漆酶的激活作用均不明显，这与王方忠[6]等的研究结果相似。漆酶属于多铜氧化酶，其催化中心含有多个铜离子，Cu2+可显著提高漆酶活性。除Na+对木质素过氧化物酶有激活作用外，K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+均可不同程度地抑制香菇木质纤维素酶活性。

本研究仅分析了6种金属离子对香菇羧甲基纤维素酶、漆酶和木质素过氧化物酶活性的影响，未对淀粉酶、滤纸纤维素酶、葡萄糖苷酶、锰过氧化物酶等其他胞外酶活性的影响进行分析，且金属离子种类众多，不同金属离子对不同胞外酶活性的影响效果不一致，因此还需进一步开展金属离子对香菇胞外酶系影响的系统研究。

参考文献：

[1]Zheng Y,Hao M,Nan H,et al.Relationship of chemical composition and cytotoxicity of water-soluble polysaccharides from Lentinus edodes fruiting bodies[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,2015,28(3):1069-1074.

[2]Bisen PS,Baghel RK,Sanodiya BS,et al.Lentinus edodes:a macrofungus with pharmacological activities[J].Current Medicinal Chemistry,2010,17(22):2419-2430.

[3]Nagashima Y,Yoshino S,Yamamoto S,et al.Lentinula edodes mycelia extract plus adjuvant chemotherapy for breast cancer patients:results of a randomized study on host quality of life and immune function improvement[J].Molecular and Clinical Oncology,2017,7(3):359-366.

[4]张晓昱.香菇不同菌株胞外酶活性与生长发育的关系[J].华中农业大学学报，1995，14（3）：259-262.

[5]王伟科，陆娜，周祖法，等.不同基质中香菇菌丝生长期胞外酶活性变化的研究[J].安徽农业科学，2014，42（14）：4176-4178.

[6]王方忠，朱启忠，董学卫，等.香菇漆酶的纯化及部分性质研究[J].北方园艺，2008（6）：36-38.

[7]王鼎，曾东方，池汝安，等.3,3-二甲基联苯胺法测定香菇漆酶活性研究[J].江苏林业科技，2008，35（5）：12-16.

[8]祝子坪，李娜.桑黄菌发酵过程中酶活性的变化[J].中草药，2014，45（3）：420-424.

[9]程旺开.金属离子对纤维素酶活性影响的研究[J].安徽农学通报，2011，17（5）：27-28.

[10]赵玉蓉，金宏，陈清华，等.金属离子对纤维素酶及木聚糖酶活性影响的研究[J].饲料博览，2005（1）：1-3.