伤科紫草油微生物限度检查方法的验证

赵毛香 黄晓冰钟碧莲 王 凌

（广州中医药大学附属骨伤科医院药学部，广东 广州 510375）

伤科紫草油为我院注册制剂，主要成分为紫草、大黄、白及等，具有清热凉血，活血解毒，逐瘀止痛等功效，临床用于跌打损伤、骨折肿痛、软组织损伤及烫伤未溃等，疗效确切，不良反应少[1]。为了有效控制伤科紫草油的质量，保证微生物限度检查结果的准确性，确保方法的科学性，本文根据 《中华人民共和国药典》2010年版一部附录微生物限度检查方法的要求[2]，对伤科紫草油微生物限度检查方法进行验证，验证内容包括细菌、霉菌和酵母菌的计数方法，以及金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等控制菌检查方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 电子分析天平 （JA1103），台式灭菌器（MOST-T），台式高速离心机 （TGL-16G），干热灭菌器（BOS-150）， 生化培养箱 （LRH-70）。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63501]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉菌 [CMCC(F)98003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、铜绿假单胞菌 [CMCC(B)10104]，购于中国药品生物制品检定所。

1.3 培养基 营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、卵黄氯化钠琼脂培养基，购于广东环凯公司。

1.4 稀释剂 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%的无菌氯化钠溶液，按2010年版 《中华人民共和国药典（一部）·附录》方法配制。

1.5 样品 伤科紫草油 （批号：110801、110802、110803），由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室生产。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌接种至营养肉汤中，置于37℃培养箱中培养24 h，白色念珠菌接种至改良马丁培养物，25℃培养24 h。上述菌种各取1 mL，加入0.9%的无菌氯化钠溶液9 mL，稀释至菌悬液浓度为50～100 cfu/mL。黑曲霉采用斜面培养，置于20℃培养箱培养1周后加3～5 mL 0.9%的无菌氯化钠溶液 （含0.05%聚山梨酯80），洗下霉菌孢子，取孢子菌液，加入0.9%的无菌氯化钠溶液 （含0.05%聚山梨酯80）稀释为50～100 cfu/mL的孢子悬液。

2.2 供试液的制备 取本品10 mL，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，振摇5 min，混匀，作为1∶10的供试液。

2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证

2.3.1 试验组 分别取1 mL供试液和试验菌液，菌液浓度为50～100 cfu/mL，采用平皿培养法，平行制备2个平皿，根据2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法试验。

2.3.2 菌液组 取1 mL试验菌液，菌液浓度为50～100 cfu/mL，采用平皿培养法，平行制备两个平皿，根据2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法试验，测定试验中加入的活菌数。

2.3.3 供试品对照组 取供试液，根据2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法试验，测定供试品本底菌数。

各试验菌开展独立的平行试验，分别进行3次，计算每次试验的回收率。各菌株回收率=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数×100%。结果见表1。

表1 伤科紫草油细菌数、霉菌和酵母菌数计数验证结果

从表1可以看出：伤科紫草油根据2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法开展方法学验证试验，结果表明供试品5种菌回收率均符合药典规定的大于70%的要求，证明本品无明显抑菌作用，伤科紫草油可采用常规方法进行微生物限度检查。

2.4 控制菌 （金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌）检查方法的验证

2.4.1 阳性对照组 取10 mL供试液、1 mL金黄色葡萄球菌试验菌液 （浓度为50～100 cfu/mL），同时采用120 mL营养肉汤培养基直接培养；取10 mL供试液、1 mL铜绿假单胞菌试验菌液 （浓度为50～100 cfu/mL），同时采用120 mL胆盐乳糖培养基直接培养。根据2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法开展试验。

2.4.2 阴性菌对照组 取10 mL供试液、1 mL大肠埃希菌试验菌液 （浓度为50～100 cfu/mL），同时采用120 mL营养肉汤培养基直接培养；取10 mL供试液、1 mL大肠埃希菌试验菌液 （浓度为50～100 cfu/mL），同时采用120 mL胆盐乳糖培养基直接培养。根据2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法开展试验。

2.4.3 供试品对照组 取供试液适量，根据2010年版《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法的要求，采用常规检查法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌进行检查。

各试验菌开展独立的平行试验，分别进行3次，试验结果见表2。

表2 伤科紫草油控制菌常规检查法验证结果

由表2可知，阳性对照组检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，阴性菌对照组和供试品对照组均未检出，表明可用常规法对伤科紫草油进行控制菌检查。

3 成品微生物限度检查

取3批伤科紫草油，根据2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》微生物检查方法的要求，采用常规方法进行检查。检验结果见表3。

表3 伤科紫草油微生物限度检查结果 （cfu/mL）

由表3可知，对伤科紫草油采用常规法进行微生物限度检查，结果均符合2010年版 《中华人民共和国药典 （一部）·附录》中搽剂微生物限度标准。

4 讨论

药品微生物限度检查是控制药品质量的一项重要指标，为了保证方法的可靠性，使实验结果尽可能与药品中所含微生物的真实值接近，必须根据2010年版《中华人民共和国药典》的规定进行方法验证[3]。

微生物限度方法学验证试验中所用的标准菌种的传代次数不得超过5代，并需要定期进行菌种鉴定，以检查菌种有无变异或污染，保证验证结果的准确性。枯草芽孢杆菌在平皿上生长时容易粘连成片，影响计数，可将50～100 cfu菌液于平皿上充分点散开，倒入琼脂后充分摇匀，菌落呈点状，易于计数[4]。

跌打损伤、骨折肿痛、软组织损伤及烫伤未溃等，治宜清热凉血，活血解毒，逐瘀止痛。伤科紫草油是由多味中药制成的复方制剂，方中紫草性味苦寒，有清热凉血、活血解毒、透疹消斑之功效，为主药；辅以大黄凉血解毒、泻下攻积、逐瘀通经；佐以冰片芳香走窍，清热止痛。诸药合用，共奏清热凉血，活血解毒，逐瘀止痛等功效，临床上使用多年，疗效显著，期间未发现相关不良反应报告。

中药成分复杂，对制剂成品中的微生物可能存在一定的抑制作用[5]，在开展中药制剂微生物质量检查中应进行方法学验证，以确定采用的方法的科学性，确保方法的准确性。伤科紫草油作为一种处方组方复杂的中药制剂，存在控制菌的潜在污染，本研究按照2010年版 《中华人民共和国药典》的规定，对伤科紫草油的微生物限度检查方法进行验证，确定了伤科紫草油的微生物限度检查方法，保证了方法的科学性和准确性，从而确保药品的质量安全，同时为我院医院制剂质量标准的修订和完善提供了一定的参考。

[1]胡超燕.伤科紫草油治疗闭合性骨质并发张力性水泡的疗效研究[D].广州：广州中医药大学，2015.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京:中国医药科技出版社，2010:附录 79-88.

[3]严晓明，刘萌，朱燕.四种医院制剂微生物限度检查方法学验证[J].中国药事，2015，29（5）:485-491.

[4]李卓亚，袁继承.散结止痛颗粒微生物限度检查方法的验证[J].海峡药学，2017，29（6）:37-38.

[5]李建志，王晓源，王亚贤.8种中草药抗菌作用实验研究[J].中医药信息，2015，32(1)：32-34.