组合外源添加剂对杂交狼尾草厌氧发酵产沼气的影响

白顺星，龚舒静，杨 姝，秦向东 *，马胡坚，张光东，马俊花

(1. 云南农业大学理学院，云南 昆明 650201；2. 云南省高校生物天然气产业化技术工程研究中心，云南 昆明 650201；3. 云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)

【研究意义】能源草作为生物质能源开发的原料不仅能利用贫瘠山坡地而且具有成本低、效率高、无污染的优点。狼尾草属于禾本科，全世界约有140种，广泛分布于热带、 亚热带，少数种类可达温带地区[1]。其中杂交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureum)是由1年生二倍体美洲狼尾草(P.americanum；2n-2x-14，AA)作为母本和多年生四倍体象草(P.purpureum)作为父本远缘杂交获得的三倍体不育杂交种，综合了母本品质优和父本产草量高、抗逆性强、可多年生的特性[2-3]。由于它具有的这些特性，近年来杂交狼尾草作为厌氧发酵原料的研究日益增多[4-8]。【前人研究进展】在厌氧发酵体系中微量元素对维持整个发酵体系稳定、彻底分解发酵原料有很大的作用，微量元素不仅参与合成体系中的厌氧微生物而且还能激活厌氧体系中各种酶的活性[9-11]。Speece[12]指出由于不同厌氧消化菌的不同种微量元素含量不同，即使是同种产甲烷菌在不同环境中它所含的微量元素也不尽相同，以Fe、Co、Ni为序，只有当前一营养元素足够时，后面一个才能对甲烷菌的生长起激活作用。此外，由于秸秆类能源作物的木质纤维素含量较高，木质素，半纤维素和纤维素之间紧密交联使纤维素难于降解，严重制约了其厌氧发酵效率。对原料进行碱预处理能够有效提高其产气效率，但是处理过的原料还需用酸进行中和才能进行厌氧发酵，给原本低成本、低收益沼气工程增添了设备和技术难点[13]。相比较而言，在厌氧消化系统中加入水解酶，不仅操作简便，也能有效提高厌氧发酵的沼气产量[14]。此外，螯合剂和表面活性剂的添加也有利于厌氧发酵产沼气[15-16]。【本研究切入点】以上研究都是单一添加剂对厌氧发酵的影响，复合添加剂对厌氧发酵的影响研究较少。文章以杂交狼尾草为发酵原料，外源添加混合的FeCl2、CoCl2、NiCl2、纤维素酶、吐温20、EDTA-2Na，以累积产气量和辅酶F420的含量作为指标，评价组合添加剂作用下厌氧系统产气潜力。【拟解决的关键问题】以期找到促进沼气产量的各个添加物的最佳组合方式及组合水平。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杂交狼尾草：2013年9月采自云南农业大学后山，为自种杂交狼尾草(Penniseturmamericanum×P.purpureum)的地上部分，阴干后切成2～3 cm段，常温密封保存备用。样品总固形物(total solid，TS)含量为88.5 %，挥发物(volatile solid, VS)含量为80.4 %。

活性污泥：2014年10月采自昆明蒜村生活污水沟，室温密封保存，用前驯化。其TS含量为14.5 %，VS含量为29.9 %。

仪器：DZKW-S-8型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；GT901型甲烷测定仪(深圳科尔诺电子科技有限公司)；DHG-9053A型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SX2-2.5-10马弗炉(上海实研电炉有限公司)；ISO9001电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；JS-30A电子计数天平(成都普瑞逊电子有限公司)；722型可见分光光度计(上海光学仪器厂)；DFT-100手提式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；自制厌氧发酵装置：主要由恒温水浴锅、发酵瓶、集气瓶、集水瓶组成，装置之间均采用玻璃导管和橡胶管连接，保证厌氧环境。

试剂：FeCl2、CoCl2、NiCl2、酵母提取物、纤维素酶(1500 U/g)、吐温20(0.01 %)、EDTA-2Na、精密pH试纸。

1.2 试验方法

1.2.1 正交试验设计 在前期单因素试验[17]及参考相关文献的基础上，选定FeCl2、CoCl2、NiCl2、纤维素酶、吐温20、EDTA-2Na 6种添加剂，以累积产气量为考查指标，采用L25(56)正交表对添加剂组合进行设计。每个因素各设置5个水平，如表1所示。试验共包含25组，每组试验设置3个平行。

1.2.2 厌氧发酵试验 采取批次进料发酵方法，1 L自制厌氧反应器，各组料液质量为500 g，TS浓度为6 %，接种率为20 %(按照接种物与杂交狼尾草的VS计算)，初始pH值7.0，分别加入不同的添加剂组合后，观测中温35 ℃条件下厌氧发酵35 d的产气情况。每日固定时间检测日产气量、料液pH值及甲烷浓度。发酵结束后选择代表性试验组测定体系辅酶F420含量。

1.2.3 各种指标的测定 含水率和总固体(TS)质量分数采用(105±5) ℃下干燥恒重法；挥发性固体值(VS)采用(550±20) ℃下灼烧恒重法；日产气量采用排水法测定；甲烷体积分数采用GT901型甲烷测定仪测定；料液pH值用精密pH试纸测定；单位原料干物质产气量(TS产气率)、单位原料挥发性有机物产气量(VS产气率)均通过公式计算得出；辅酶F420含量采用紫外可见分光光度法测定。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 L25 (56) 试验方案及结果Table 2 L25(56) orthogonal test design and results

1.2.4 数据处理及分析 数据处理采用Excel2003进行，方差分析采用SPSS18.0完成。

2 结果与分析

2.1 组合添加剂对累积产气量的影响

组合添加剂作用下的正交试验设计及结果如表2所示，其中试验1为空白对照组，试验2-25为添加剂组。对正交试验累积产气量的直接对比分析显示，24个添加剂组中，累积产气量较空白对照组高的有22个组，占添加剂组总数的91.7 %，产气量增加介于2.72 %～27.64 %。有7个组的累积产气量较对照组增加20 %以上，有10个组的产气增加量介于10 %～20 %，5个组产气增加量在10 %以内，仅有2个组的累积产气量低于对照组。试验7累积产气量最多，达10 170 mL(折合原料TS产气率619.5 mL/g)，比对照组增加27.64 %；其次是试验19，产气9885 mL，比对照组产气增加24.06 %。试验9产气7 543 mL，较对照组减少5.33 %；试验12产气7258 mL，较对照组减少8.91 %。结果显示：6种添加剂不同水平的组合对累积产气量均能产生较为明显的影响，整体而言，添加剂的使用有助于提高杂交狼尾草厌氧发酵产气量。

直观分析结果显示：纤维素酶这一因素极差最大，为1734.2 mL；FeCl2这一因素极差最小，为155.0 mL，说明纤维素酶添加量的变化对系统产气量的影响最大，而FeCl2的添加量对系统产气量的影响最小。从极差的比较可以看出，各因素影响杂交狼尾草厌氧发酵产气量的顺序为纤维素酶>EDTA-2Na >吐温20>CoCl2> NiCl2> FeCl2。试验中较优添加配方为A2B2C3D4E5F1，而根据正交试验k值可知，理论优化方案为A1B3C2D4E4F1，考虑在甲烷菌所需营养元素中，Fe元素是排在第一位的金属元素，Fe元素的不足会抑制其他元素发挥作用[12]。因此最终确定的优化方案为A4B3C2D4E4F1，即FeCl2添加10.0 mg/L、CoCl2添加1.0 mg/L、NiCl2添加1.0 mg/L、纤维素酶添加15 g/L、吐温20添加250 mg/L、不添加EDTA-2Na。在相同发酵条件下对理论优化方案进行验证，系统累积产气量平均值达10 320 mL，较空白对照组提高29.52 %。

2.2 组合添加剂对产气过程的影响

通过比较添加剂组与空白对照组日产气量变化趋势(图1)，可以发现，杂交狼尾草厌氧发酵过程均显示有3个产气高峰，其中又以第二、三产气高峰为主，添加剂对产气过程的作用主要体现在对产气峰值、产气高峰出现时间及延续时间的影响上。整体而言，组合添加剂的加入会使主产气高峰推迟出现，但能提高产气高峰值及延续时间。其中，对照组的第二、三产气高峰分别出现在第14、22天，峰值分别为440 和308 mL，与对照组相比主要产气高峰(第二高峰)明显提前的有2个试验组(试验7、13)，峰值分别为560 和590 mL。主要产气高峰延后出现的有13个试验组，峰值介于340～470 mL。本研究所选添加剂中，能够使产气高峰出现时间提前的有FeCl2、CoCl2、NiCl2，而纤维素酶与吐温20在添加量较高时，会导致产气高峰出现时间延后[16]，EDTA-2Na对产气峰值出现时间的影响尚不明确。

2.3 组合添加剂对甲烷菌活性的影响

作为产甲烷菌特有的一种与甲烷形成过程密切联系的辅酶，F420可作为氢化酶系统中低电位电子转移的载体，在甲烷的形成过程中起着重要的作用。辅酶F420在波长420 nm的紫外光激发下，能产生自发蓝绿荧光，该特性可以用来对F420进行定量分析。由于F420在产甲烷过程中的重要作用，厌氧处理中经常以F420的含量作为判断产甲烷菌产甲烷活性的标准[18]，辅酶F420含量越高，指示甲烷菌产甲烷活性越大。

图1 各试验组日产气量随时间变化Fig.1 Tendency of daily gas production of experimental groups

图2 累积产气量与辅酶F420含量关系Fig.2 Relational graph between accumulated gas production and concentration of coenzyme F420

本研究选取了正交试验中累积产气量最高的2组(试验7、19)、居中的2组(试验5、25)、最低的2组(试验9、12)以及对照组(试验1)进行辅酶F420含量的测定，每组平行测定3次，结果(图2)显示：沼气产量越高的试验组其辅酶F420的含量也越多，其中产气量最高的试验组(试验7)中辅酶F420含量达10.97 μmol/L，较对照组提高43.6 %。累积产气量的变化趋势与厌氧系统中辅酶F420含量的变化趋势基本一致，说明外源添加剂的加入能够对甲烷菌活性形成影响，进而对厌氧发酵的产气效率形成影响。整体而言，组合添加剂对提高甲烷菌活性有明显的促进作用。

对厌氧系统辅酶F420含量和累积产气量进行相关性分析，两者之间的Pearson相关系数达0.917，观测到的显著性水平小于0.001，低于理论显著性水平0.01，说明辅酶F420含量和累积产气量存在极显著正相关。两者关系的拟合曲线见图3，拟合方程为：y=15.611x3-564.14x2+7137.3x-20 802，R2=0.8726。

2.4 组合添加剂中各因素对厌氧发酵的影响

正交试验的统计分析结果见表3，各因素的因素效应见图4。

2.4.1 FeCl2对产气量的影响 研究[19]显示Fe2+对太湖蓝藻厌氧消化过程中相关酶活性存在影响，能够进一步提高其厌氧产甲烷的能力。由方差分析结果可知，FeCl2对累积产气量的影响不显著(P>0.05)。FeCl2的因素变化效应曲线同样显示：整体而言，组合添加模式下的FeCl2，其添加量上的变化对杂交狼尾草厌氧系统产气量影响较小。当添加量为0.0、2.5、5.0、10.0、15.0 mg/L时，其累积产气量均值分别为9035、8880、8896、9000、9014 mL，在2.5～15.0 mg/L内添加量与产气量呈现弱的正相关。

图3 累积产气量与辅酶F420含量间的拟合曲线Fig.3 Fitted curve between accumulated gas production and concentration of coenzyme F420

2.4.2 CoCl2对产气量的影响 适量添加CoCl2除了能够提升系统产气量，还能提高系统稳定性[17,20]。方差分析显示，CoCl2对累积产气量的影响为极显著(P<0.01)。当CoCl2添加量为0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L时，其累积产气量均值分别为8656、8943、9206、9140、8879 mL。在0.0～1.0 mg/L内添加量与产气量呈现明显正相关，添加浓度超过1.0 mg/L产气量随CoCl2添加量的增加而逐渐下降。

2.4.3 NiCl2对产气量的影响 添加NiCl2有缩短系统产气时间、提高系统产气稳定性的作用[17,20]。方差分析显示，NiCl2对累积产气量的影响不显著(P>0.05)。当NiCl2添加量为0.0、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L时，其累积产气量均值分别为8949、9092、9062、8839、8883 mL。在0.0～1.0 mg/L内，添加量与产气量呈现正相关，添加浓度超过1.0 mg/L产气量随NiCl2添加量的增加而逐渐下降。

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Variation analysis for orthogonal test

2.4.4 纤维素酶对产气量的影响 纤维素酶能有效分解原料中的纤维素，促使厌氧体系快速启动，有利于提高原料转化率。方差分析显示，纤维素酶对累积产气量的影响为极显著(P<0.001)。当纤维素酶添加量为0.0、5.0、10.0、15.0、20.0 g/L时，其累积产气量均值分别为7787、8894、9062、9612、9279 mL。在0.0～15.0 g/L内，添加量与产气量呈现正相关，当添加浓度超过20.0 g/L时产气量开始下降。

2.4.5 吐温20对产气量的影响 有研究[16]表明吐温20的加入有助于改善微生物细胞的通透性和金属离子生物利用的有效性，从而可以改善金属离子生物利用效率。方差分析显示，吐温20对累积产气量的影响为极显著(P<0.001)。当吐温20添加量为0.0、62.5、125.0、250.0、500.0 mg/L时，其累积产气量均值分别为8943、8605、8866、9245、9166 mL。在62.5～250.0 mg/L内添加量与产气量呈现正相关；添加浓度超过250.0 mg/L产气量变化不大。

2.4.6 EDTA-2Na对产气量的影响 研究[21]表明，加入金属添加剂的同时加入螯合剂能够防止金属离子水解或转化为硫化物，有助于维持金属离子的有效浓度，从而促进厌氧发酵的进行。方差分析显示，EDTA-2Na对累积产气量的影响为极显著(P<0.001)。当EDTA-2Na添加量为0.0、0.93、1.86、3.72、7.44 g/L时，其累积产气量均值分别为9333、9193、8983、8654、8661 mL，在0.0～3.72 g/L内添加量与产气量呈现负相关，添加浓度超过3.72 g/L产气量变化不大。本试验添加EDTA-2Na呈现明显的抑制作用，可能是因为浓度过高，过量的EDTA-2Na结合微生物细胞膜表面上的金属离子，造成菌体死亡进而使厌氧发酵产气量减少[22]，其添加浓度有待进一步优化。

3 讨 论

添加剂的应用已经成为改善厌氧系统产气效率的重要手段，向沼气发酵液中添加适量的金属离子、酶、代谢促进物、吸附剂、螯合剂等均能在一定程度上起到提高沼气产量的作用[16]。不同种类添加剂之间在作用原理及呈现效果上存在很大的差异性。金属离子能够满足甲烷菌生长对无机营养元素的需要，进而有效改善厌氧消化的效率、产气量和甲烷含量，抑制酸积累[23]。酶作为一种高活性生物催化剂，能够提高物料中纤维素类成分的降解速度，提高物料转化效率，进而影响整个厌氧发酵过程。表面活性剂可以改善生物细胞通透性，虽然单独添加表面活性剂并不能提高原料利用率，但有可能通过增加单位质量底物产气效率的方式，最终引起产气量的增加[16]。在有机物厌氧消化过程的3个阶段中，系统酸化是厌氧消化系统中需要解决的关键抑制因素之一，螯合剂的加入可以提高系统有机酸的利用或消耗速度，控制酸化程度及其不利影响[24]。吸附剂类添加剂则是通过加速发酵基质在其吸附点的积累，从而为微生物提供有利的生长环境。

相对于单一添加剂而言，多种成分构成的组合添加剂在提高厌氧体系产气量、稳定产气过程、提高甲烷菌活性等方面的应用效果更为突出。研究显示，金属离子-金属离子[23]、金属离子-螯合剂[21, 24]、金属离子-表面活性剂[16]、尿素-吸附剂[25]等多种类型的组合添加剂均能够呈现更好的促产气效果。不同组分的存在能够满足厌氧系统持续运行的不同要求，同时各组分间的协同效应又使其效果得到进一步加强。充分利用好这种协同作用，对不同类型添加剂进行优化组合，有助于提高各个阶段的处理效率，并最大程度地提高沼气产气量。但是当前对沼气发酵外源添加物的研究主要集中在不同添加物的促气效果等方面，关于协同作用机理的研究仍需深入开展[26]。

添加剂组合方式不同促产气效果差异明显，说明不同添加剂间可能存在协同效应。本研究确定的较优方案为：FeCl210.0 mg/L、CoCl21.0 mg/L、NiCl21.0 mg/L、纤维素酶15 g/L、吐温20 250 mg/L、不添加EDTA-2Na，该条件下杂交狼尾草厌氧发酵累积产气量较对照组提高了29.53 %。

4 结 论

向产沼气系统中加入外源添加物，通过不同类型外源添加物的优化组合，发挥协同作用，可以提高厌氧菌活性，改善厌氧发酵各阶段的作用效率，从而提高沼气产量。

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