靶向Cyclin D1基因RNA干扰对肝癌细胞增殖和Mdm2等基因表达影响的研究*

张弘英，胡树根，胡利琳，丁 浩△

(1.南昌大学第二附属医院消化内科，南昌 330006；2.江西省南昌市新建区人民医院 330100； 3.南昌大学医学院，南昌330006)

细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是调控细胞周期G1期的关键蛋白之一，已被证明与包括肝癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展相关[1]。Mdm2和Mdm4在许多肿瘤中都存在着过度表达的现象[2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)因其恶性程度较高，预后差，被称为“癌中之王”[3]，其在我国发病率和病死率均较高[4]，然而针对HCC的治疗方法均不是很理想。本文研究靶向Cyclin D1基因RNA干扰对肝癌细胞增殖和Mdm2、Mdm4、P53和P21基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人肝癌细胞株Hep3B由本研究组保存；培养基MEM和胎牛血清(美国Gibco)；Cyclin D1-siRNA和NC-siRNA(上海吉凯)，Cyclin D1-siRNA序列的抑制效果在本研究组以往实验中得到了证实；Trizol及脂质体LipofectamineTM(美国Invitrogen)；2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物)；细胞活力检测试剂MTT(上海索莱宝生物)；TUNEL凋亡原位检测试剂盒(上海生工生物工程)；蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物)；逆转录试剂盒(大连宝生生物TaKaRa)；引物(上海吉玛)；Ⅰ抗Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21及β-actin(美国Santa Cruz)；Ⅱ抗HRP-Goat anti Mouse IgG(北京中杉金桥)。

1.2方法

1.2.1细胞培养和siRNA转染 把Hep3B细胞放在含有100 μg/mL的链霉素、100 U/mL的青霉素及10%胎牛血清的MEM培养基的细胞培养瓶内，并置于饱和空气湿度、温度37 ℃及5%CO2孵箱里培养。细胞以1×106个/孔的密度平铺在六孔板内。孵育24 h后细胞融合率大约为90%。使用脂质体LipofectamineTM2000将Cyclin D1-siRNA和NC-siRNA转染细胞。Cyclin D1-siRNA序列：5′ACAAACAGATCATCCGCAA3′，NC-siRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。siRNA浓度为100 nmol/L，脂质体每孔5 μL介导转染，转染后48 h收获细胞。实验分为空白对照组、阴性对照siRNA(NC-siRNA)组、Cyclin D1-siRNA组。实验每组重复6次。

1.2.2RT-PCR检测Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21 mRNA的表达 配制PCR反应体系:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 500 ng，补充三蒸水至终体积25 μL。PCR反应条件：1个循环预变性，95 ℃ 5 min；36个循环PCR反应，95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s,72 ℃ 60 s；延伸 72 ℃ 8 min。每个基因取同等量的PCR产物置于琼脂糖凝胶孔中进行电泳，利用暗箱式紫外透射仪(上海精科)观察电泳结果并拍照。最终数据以目的条带/β-actin的灰度值表示，结果用BANDLEAD 3.00软件分析。基因引物序列及产物大小见表1。

1.2.3Western blot检测Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53和P21蛋白的表达 提取总蛋白使用放射免疫沉淀试验法，检测蛋白质浓度使用二喹啉甲酸法。提取20 μg蛋白质进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白转移至NC膜上,然后用5 g/100 mL脱脂奶粉液于4 ℃封闭过夜。NC膜用相应的Ⅰ抗(1∶200比例稀释) 于4 ℃孵育过夜，继以Ⅱ抗孵育2 h，最终用DAB显色照相。结果以目的条带/β-actin的灰度值表示，用软件Quantity One分析。

表1 各基因引物序列和产物大小

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期 获得上述各组细胞，使用流式细胞仪(美国Beckman公司)分析得出细胞各周期的百分率。

1.2.5MTT检测细胞活力 细胞平铺于96孔板内，其中空白调零孔只加不含细胞的培养基MEM。对细胞进行处理后，每孔细胞加入5 mg/mL MTT液20 μL，接着孵育4 h，弃上清液后加入150 μL 的二甲基亚砜，剧烈混匀10 min，上酶标仪(上海Bio-Rad)于492 nm处检测各孔吸光度(A)值。

1.2.6TUNEL检测细胞凋亡 用PBS洗细胞3次×5 min。加入4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，PBS洗3次×5 min。加入0.1% Triton X-100溶液室温破膜10 min，PBS洗3次×5 min。实验组每片以5 μL末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)及45 μL荧光素标记的dUTP液混匀。玻片干后，加50 μL TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中37 ℃反应60 min。PBS洗3次×5 min。玻片干后加50 μL converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中37℃反应30 min。PBS洗3次×5min。在组织处加适量DAB底物，显微镜下控制显色。PBS终止显色。苏木素复染，中性树胶封片。观察，拍照。每张切片于200倍镜下随机选择4个视野，计算阳性细胞数为凋亡指数。

2 结 果

2.1各组Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21 mRNA的表达 与空白对照组和NC-siRNA组相比，Cyclin D1-siRNA组P53和P21 mRNA的表达上调(P<0.05)，Cyclin D1、Mdm2和Mdm4 mRNA的表达下调(P<0.01)；而空白对照组与NC-siRNA组之间相比，各基因表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

2.2各组Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21蛋白的表达 与空白对照组和NC-siRNA组相比，Cyclin D1-siRNA组P53和P21蛋白的表达上调(P<0.01)，Cyclin D1、Mdm2和Mdm4蛋白的表达下调(P<0.01)；而空白对照组与NC-siRNA组之间相比，各蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

表2 流式细胞仪检测细胞周期

*：P>0.05，与空白对照组和NC-siRNA组比较

2.3各组细胞周期 与空白对照组和NC-siRNA组相比，Cyclin D1-siRNA组细胞G1、S及G2期均无明显差异(P>0.05)；空白对照组与NC-siRNA组之间比较，各期差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图3。

A：空白对照组；B：NC-siRNA组；C：Cyclin D1-siRNA组；*：P<0.05，与空白对照组和NC-siRNA组比较

图1各组Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21 mRNA的表达

A：空白对照组；B：NC-siRNA组；C：Cyclin D1-siRNA组；*：P<0.01，与空白对照组和NC-siRNA组比较

图2各组Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53、P21蛋白的表达

A：空白对照组；B：NC-siRNA组；C：Cyclin D1-siRNA组

图3各组细胞周期情况

2.4各组细胞增殖活力 与空白对照组和NC-siRNA组相比，Cyclin D1-siRNA组细胞增殖活力明显减弱(P<0.01)；空白对照组与NC-siRNA组细胞增殖活力差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

A：空白对照组；B： NC-siRNA组；C：Cyclin D1-siRNA组；*:P<0.01，与空白对照组和NC-siRNA组比较

图4各组细胞增殖活力

2.5各组细胞凋亡情况 与空白对照组和NC-siRNA组相比，Cyclin D1-siRNA组细胞凋亡明显增强(P<0.01)；而空白对照组与NC-siRNA组的细胞凋亡差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

A：空白对照组(×200)；B：NC-siRNA组(×200)；C：Cyclin D1-siRNA组(×200)；*：P<0.01，与空白对照组和NC-siRNA组比较

图5各组细胞凋亡情况

3 讨 论

细胞周期是确保细胞进行生命活动的基本过程，其准确调控对于生命正常生存、繁殖、发育及遗传起到了关键性作用。细胞周期的关键点是G1期的启动，而Cyclin D1是调控细胞周期 G1期的关键性蛋白[5]。Cyclin D1在肿瘤细胞中表现为表达过度，造成了G1期的缩短，过度的细胞增殖[6]。Cyclin D1已经被证实了与多种肿瘤的发生、发展有关[7]。肝癌的发生也与G/S期检测点的缺陷相关[8]。Cyclin D1表达下调可导致肝癌细胞株Huh7细胞的凋亡，使其停滞在G1期[9]。

HCC是全世界最普遍的肿瘤之一，而我国由于乙型肝炎的高发使肝癌患者占全世界的大部分[10]。目前，针对HCC的治疗方法均不理想，疗效有限。而基因治疗因其可从根本上治愈疾病，故而会是治疗HCC的新选择及新趋势。

本研究结果显示，Cyclin D1基因表达下调能抑制Mdm2和Mdm4的表达，并能上调P53和P21的表达；Cyclin D1基因表达下调能减弱肝癌细胞的增殖，并能诱导其凋亡。Cyclin D1表达下调对肝癌的细胞周期没有影响。其可能的原因是，Cyclin D1表达下调只通过细胞凋亡途径起作用，而对细胞周期通路并不产生影响。

Mdm2和Mdm4参与了多条细胞调控通路，并影响了肿瘤发生与发展的过程[11]。目前已有的研究表明，很多肿瘤中均有Mdm2和Mdm4表达过度的现象。Mdm2和Mdm4在肿瘤细胞中的过表达，导致了野生型P53的抑癌活性受抑，诱导了肿瘤形成[12]。本研究组既往的研究亦表明[13]，利用RNA干扰技术使得Mdm2表达沉默减弱了肝癌细胞增殖，并导致其凋亡；下调Mdm2的表达能上调抑癌基因P21的表达，而P21是P53途径最重要的下游基因之一。本研究发现，Cyclin D1基因表达下调能抑制Mdm2和Mdm4的表达，并能上调抑癌基因P53和P21的表达。这些均表明，Cyclin D1基因表达下调能抑制肝癌的发生和生长。沉默Cyclin D1基因的表达能造成肝癌细胞的活力下降，凋亡被诱导。这与预期实验结果一致，即Cyclin D1基因表达下调能抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡。

综上所述，Cyclin D1基因表达下调能抑制Mdm2和Mdm4的表达，并能上调抑癌基因P53和P21的表达；Cyclin D1基因表达下调能抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡。这为肝癌的基因治疗提供可能的分子作用靶点。

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