LC-MS/MS法同时测定葛根药材中14种异黄酮类成分的含量Δ

吴文杰，刘良红，黄莺（1.湖南中医药大学药学院，长沙410208；2.香港浸会大学化学院，香港；.湖南医药学院药学院，湖南怀化 418000）

葛根和粉葛分别为豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]和甘葛藤（P.thomsoniiBenth.）的干燥根，在中医用药史上二者均作为葛根（P.radix）药材使用，具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻的作用[1]。葛根和粉葛被收载于2015年版《中国药典》（一部）[2]；国家卫生和计划生育委员会发布的国卫办食品函〔2014〕975号文件中，在原有的85种药食同源产品名单（含葛根）的基础上新增了15种药食同源产品（含粉葛）[3]，这说明二者需区别对待，以保证葛根药材安全、合理使用。已有药理动物实验表明，葛根药材中的有效成分具有改善心肌代谢及血管微循环、扩张冠状血管、缓解高血压、预防心律失常、改善脑血管循环、发挥雌激素样效果、保护肝肾、抗自由基、抗缺氧症状、抗肿瘤、调节机体免疫功能、解酒等作用[4]。而异黄酮类成分是发挥药理活性的主要药效物质[5]，因此可作为葛根药材质量分析的指标性成分。

目前，葛根药材质量分析的方法主要为高效液相色谱法（HPLC）[6-7]，但是考虑到葛根药材中含有多种化学成分，基质干扰较大，会影响检测的准确性；同时其含有的一些异黄酮类成分含量较低，以HPLC法测定会由于灵敏度不够而不易被检出。液相色谱-串联质谱法（LCMS/MS）具有稳定性良好、不受杂质干扰、灵敏度高等优势[8]。中药定量分析中常用的串联质谱是三重四级杆质谱（QqQ），其在多反应监测（MRM）模式下可得到准分子离子质量和二级碎片质荷比的信息，加之该方法操作方便，故常被用于中药有效成分检测和质量控制[9-10]。但仍鲜见在MRM模式下测定葛根药材中异黄酮类成分的报道，也尚未见MRM模式结合主成分分析和聚类分析区分葛根药材的报道。

基于此，本试验采用LC-MS/MS法同时测定了葛根药材中14种异黄酮类成分的含量，用于药材的整体质量控制；同时，采用主成分分析和聚类分析法区分14批不同来源（产地或种类）的葛根药材，旨在为评价葛根药材质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器

AB SCIEX 5500型质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；1260型HPLC仪，包括柱温箱、二元溶剂管理器、自动进样器（美国Agilent公司）；AUW2200型十万分之一电子分析天平（日本Shimadzu公司）；KQ3200型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率：150 W，频率：40 kHz）。

1.2 试剂

葛根素对照品（批号：3681-99-0）、葛根素-6″-O-木糖苷对照品（批号：114240-18-5）、葛根素芹菜糖苷对照品（批号：103654-50-8）、4′-O-甲基葛根素对照品（批号：92117-94-7）、大豆苷元对照品（批号：486-66-8）、大豆苷对照品（批号：552-66-9）、芒柄花黄素对照品（批号：485-72-3）、刺芒柄花苷对照品（批号：486-62-4）、染料木苷对照品（批号：529-59-9）、染料木素对照品（批号：446-72-0）、黄豆黄苷对照品（批号：40246-10-4）、黄豆黄素对照品（批号：40957-83-3）、鸢尾苷对照品（批号：611-40-5）、鸢尾黄素对照品（批号：548-77-6）均购于上海源叶生物科技有限公司（纯度经HPLC法检测均不低于98%）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

葛根药材分别来自于我国不同地区，经昆明植物标本馆刘恩德博士鉴定为豆科葛属植物野葛[P.lobata（Willd.）Ohwi]或甘葛藤（粉葛）（P.thomsoniiBenth.）的根。葛根药材来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～30 min，20%A～70%A；30～40 min，70%A）；流速：0.8 mL/min；柱温：22 ℃；进样量：5 μL。

表1 葛根药材来源Tab 1 Sources of P.radix

2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；检测方式：负离子检测；扫描模式：MRM；喷射电压：-4 500 V；离子源温度：600 ℃；雾化气：60 psi；辅助气：60 psi；碰撞气：7 psi；气帘气：30 psi。14种待测异黄酮类化学成分的液质法参数见表2。

表2 14种待测异黄酮类成分的液质法参数Tab 2 LC-MS parameters of 14 kinds of isoflavones

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液 分别取葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、葛根素芹菜糖苷、4′-O-甲基葛根素、大豆苷元、大豆苷、芒柄花黄素、刺芒柄花苷、染料木苷、染料木素、黄豆黄苷、黄豆黄素、鸢尾花苷、鸢尾黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成相应质量浓度的单一对照品贮备液。分别量取上述单一对照品贮备液适量，逐级稀释，得质量浓度分别均为10、20、50、100、200、500、800、1 000、2 000、5 000 ng/mL的系列混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液 取药材样品粉碎，过40目筛，于40℃干燥箱中烘干至质量恒定。烘干后取0.1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL，称定质量，超声处理20 min，室温条件下放冷，用30%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过后，取续滤液并稀释至一定质量浓度（在线性范围内），即得。

2.4 专属性试验

取“2.3”项下系列混合对照品溶液、供试品溶液各5 μL，分别按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，各待测成分在样品中的提取离子流图见图1。由图1可知，各待测成分均未检测到干扰成分，表明方法专属性良好。

2.5 线性关系考察

吸取“2.3.1“项下各质量浓度的系列混合对照品溶液各5 μL，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，ng/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性范围见表3（注：考虑到葛根素含量最高，故采用的质量浓度上限为5 000 ng/mL进行回归分析，其余13种成分则采用1 000 ng/mL进行回归分析）。

2.6 精密度试验

取“2.3.1”项下混合对照品溶液（100 ng/mL）5 μL，按“2.1”“2.2”项下条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，14种待测成分峰面积的RSD均小于3.47%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

称取药材样品（编号：PL-5）粉末0.1 g，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置12、24、36、48、60、72 h时按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。结果，14种待测成分峰面积的RSD均小于5.00%（n＝6），表明供试品溶液于室温下放置72 h内较稳定。

2.8 重复性试验

称取药材样品（编号：PL-5）粉末0.1 g，共6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。结果，14种待测成分含量的RSD均小于3.93%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

称取药材样品（编号：PL-5）粉末0.1 g，共6份，分别精密加入一定量的混合对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果，14种待测成分的平均加样回收率为95%～105%，RSD为0.80%～4.50%（n＝6）。

2.10 含量测定

分别取各批药材样品适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，计算样品含量，结果见表4。

2.11 主成分分析与聚类分析

采用SIMCA 13.0软件对14批不同来源的葛根药材进行主成分投影分析，把14个成分转化为第一主成分和第二主成分两个综合性指标，详见图2。由图2可知，两个主成分的贡献率分别为71.4%和15.9%。采用SIMCA 13.0软件对14批不同来源的葛根药材进行聚类分析，详见图3。由图3可知，14批葛根药材可聚为4类：PL-2为Ⅰ类；PL-3、PL-4为Ⅱ类；PL-5～PL-7为Ⅲ类；PL-1、PT-1～PT-7为Ⅳ类。

图1 各待测成分的提取离子流图Fig 1 Extraction ion chromatograms of components to be measured

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本试验分别考察了乙腈和甲醇作为流动相中的有机相，发现乙腈和甲醇作为有机相时具有相似的色谱分离效果及质谱响应强度，但是因乙腈比甲醇昂贵且毒性更大，故选择甲醇作为流动相中的有机相。笔者又以甲醇-水进行梯度洗脱，比较了不同比例甲酸（0.1‰、0.5‰、1‰）和乙酸（0.1‰、0.2‰、0.5‰）对分离效果的影响，结果发现上述酸溶液对各待测异黄酮类成分的峰形、响应强度和分离效果并无明显影响。为使操作方法简便易行，故选择甲醇-水作为流动相。

3.2 质谱条件的优化

由于异黄酮类成分中含有1个或多个酚羟基结构，该结构容易失去氢，因此选用负离子模式进行监测，分子离子峰（监测母离子）均为[M-H]-。笔者又通过改变碰撞能量选择具有较高响应的碎片离子作为监测子离子，并使母离子和监测子离子的响应比接近1∶3，以使MRM模式效果较好。

3.3 异黄酮总含量分析

表3 回归方程与线性范围Tab 3 Regression equations and linear ranges

表4 药材样品含量测定结果（mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（mg/g）

图2 主成分投影图Fig 2 Principal component projection drawing

图3 聚类分析树状图Fig 3 Hierarchical cluster analysis diagram

由表4可知，葛根药材中14种待测异黄酮类成分的总含量范围为37.337～74.911 mg/g（PL-1～PL-7）、5.127～19.036 mg/g（PT-1～PT-7），表明野葛和粉葛中异黄酮类成分总含量存在明显差异。在14批药材中，产地为云南芒市（PL-2）和甘肃天水（PL-4）的野葛比其他产地野葛的异黄酮类总含量明显更高，产地为云南峨山（PT-1）和云南大关（PT-2）的粉葛比其他产地粉葛的异黄酮类总含量明显更高，这说明不同产地的葛根药材质量可能存在明显差异。同时，葛根素在14种异黄酮类成分中含量最高，在云南芒市（PL-2）和甘肃天水（PL-4）产野葛中其含量分别为43.735、40.998 mg/g，比其他产地野葛中的葛根素含量明显更高；在云南峨山（PT-1）和云南大关（PT-2）产粉葛中其含量分别为9.816、12.079 mg/g，比其他产地粉葛中的葛根素含量明显更高，提示葛根素可以作为反映葛根药材质量的重要指标。

综上所述，本研究所建立的LC-MS/MS法操作简单、重复性良好，可用于检测葛根药材中14种异黄酮类成分的含量，适用于该药材的整体质量控制。

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