严重少弱精子症患者微量精子冻融后行卵胞浆内单精子注射的妊娠结局分析

吴贤玲，喻乔，罗树伟，黄启江，谢舜

(湖南省计划生育研究所，长沙 410000)

男方因素导致的不育约占不育人群的30%～40%[1]，严重少弱精子症患者精子密度<1～5×106/ml，高倍视野的精液参数呈现波动[2]，有时甚至几个高倍视野才发现1条活动精子。这类患者在进行辅助生殖技术时，我们要提前对其精子进行冷冻，储备一定数量的精子以满足取卵日对精子的需求。常规精液冷冻对严重少弱精子症患者应用效果较差，且较难回收精子，随着技术的发展，可以对严重少弱精子症患者采取微量精子冷冻保存[2]，然后行微量精子冻融后卵胞浆内单精子注射(ICSI)，但其临床应用效果如何目前还不太明确。本研究旨在对微量精子冻融后行ICSI的妊娠结局进行分析，以期为严重少弱精子症患者的临床治疗提供参考。

一、资料与方法

1. 研究对象及分组：回顾性分析2015年1月至2016年6月在本中心行辅助生殖技术助孕的严重少弱精子症患者96例(100个治疗周期)的临床资料。纳入标准：(1)所有患者经至少3次精液常规分析检查后诊断为严重少弱精子症(精子浓度<1～5×106/ml)，排出精液高倍镜下能够找到活动精子，精液体积大于1 ml；(2)所有患者均为男性因素不育；(3)无家族病史。排除标准：夫妻双方染色体检查结果不正常者。

根据所用精子的不同进行分组：43例患者(45个周期)使用冻融精子，即冻融精子组；53例患者(55个周期)使用新鲜精子，即新鲜精子组。

2.精液标本的收集和处理：所有患者均于禁欲2～5 d后自慰方式取精，取精前排小便，清洁会阴，手淫法将精液完整收集到一次性无菌无毒的专用取精杯内，标本采集在本中心指定的取精室进行。精液取出后立即置于37℃恒温箱中液化15 min，加入精子分离上下层梯度介质(Isolate，Irvine，美国)洗涤精液1次，去上清后加入1 ml洗精受精液(G-IVF，Vitrolife，瑞典)进行离心，离心1次后去上清，并保留少量液体于离心管中，轻轻晃动离心管混匀精液后，取少量洗涤后的精液于显微镜下观察都有活动精子。冻融精子组对精子进行微量冷冻，以1∶1比例加入已预温的精子冷冻液混匀后冷冻；新鲜精子组则取少量沉淀置于离心管中等待ICSI使用。精液质量评估标准参考世界卫生组织(WHO)《人类精液检查与处理实验室手册》第五版[3]内容。

3.促排卵方案：所有患者均采用标准黄体期短效长方案，黄体中期开始皮下注射曲普瑞林(达必佳，辉凌，德国)0.1 mg/d，降调18 d，达到降调标准后，予重组人卵泡刺激素(果纳芬，默克雪兰诺，瑞士)150～225 U/d和人绝经期促性腺激素(乐得宝，珠海丽珠)75 U/d促排卵，当优势卵泡直径≥18 mm时，于当晚注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，34～36 h后常规超声引导下行取卵术，于体视镜下获取卵冠丘复合物，将卵冠丘复合置于G-IVF受精液中培养。

4.精子微量冷冻及复苏：双人核对确认后，将离心后的精液沉淀与精子冷冻液(Irvine，美国)1∶1混匀，取少量混匀液放置于冷冻麦管上，在液氮上方停留数分钟后投入液氮内保存。解冻时，双人核对确认后，从液氮中取出冷冻的精液，置于37℃石蜡培养油(Vitrolife，瑞典)中快速复温，准备行ICSI操作。本研究冻融精子组微量精子冻融复苏后均能找到活动精子用于ICSI操作。

5. ICSI及妊娠判断：HCG注射后39～40 h拆除颗粒细胞，选择MⅡ期卵母细胞行ICSI操作。第1天观察受精情况，第2天观察胚胎卵裂情况，第3天观察胚胎卵裂情况并进行评分，评判出优质胚胎和可利用胚胎。优质胚胎评价标准：取卵后第1天(D1)观察为双原核(2PN)，D2无多核现象，D3的细胞数≥7细胞，细胞大小均一或略有不均，形状基本规则，碎片≤20%。所有患者根据个人意愿及胚胎情况移植1～2枚胚胎，移植胚胎均达到胚胎评价标准中的可用胚胎。

移植后12 d测晨尿并同时抽血，如HCG(+)则为生化妊娠，移植后28 d行B超检查提示孕囊及心管搏动者则为临床妊娠。

二、结果

1. 两组患者一般情况比较：两组患者的女方年龄、不育年限、获卵数、移植胚胎数比较均无统计学差异(P0.05)(表1)。

2. 两组患者临床结局比较：两组患者的受精率、优胚率、可利用胚胎率、生化妊娠率、临床妊娠率、流产率比较均无统计学差异(P0.05)(表2)。

表1 两组患者一般情况比较(-±s)

表2 两组患者临床结局比较(%)

三、讨论

有学者研究认为，冷冻精子并不会影响小鼠的胚胎发育和表观遗传重组动态进程[4]。Di santo等[5]的研究表明，精子短暂接触冷冻保护剂，冻存在液氮内，可保存很长时间，并且冷冻复苏精子组的妊娠率和新鲜精子组对比无显著差异，精子质量不会随时间推移而有明显不良改变。Feldschuh等[6]报道使用冷冻28年的精子授精后成功出生了孩子。因此精子冷冻保存是一种安全有效的保存男性生育能力的方法。ICSI已作为常规技术应用于辅助生殖领域，精液冷冻结合ICSI技术为少精子症患者带来了福音，且有研究证实精液的质量和来源并不影响ICSI的受精及早期妊娠结局[7-8]。无精子症和严重少弱精子症等严重男性不育症患者行ICSI助孕，其子代的出生缺陷情况与其他较好精子或正常精子行ICSI/IVF助孕的子代相比无明显增加，Y染色体AZF基因检测也没有新增缺失位点和病例，这在一定程度上解除了为这些子代身心健康的担忧[9]。

本中心采用的微量自精冻融方法，对于严重少弱精子症精患者或者需多次冷冻才能储备一定数量的精子以满足取卵日需求的患者，有十分重要的意义。程序冷冻或非程序的缓慢冷冻是两种传统的精子冷冻保存方法，冷冻过程中经历的理化效应直接作用于精子，造成DNA损伤、DNA碎片指数升高[10]，以及精子膜结构不可逆的损伤等。对于中重度少弱精子症患者而言，采用常规的冷冻方法会使极少量的精子暴露在大量高浓度的渗透性冷冻保护剂中，会加剧冷冻过程对精子的损伤作用，从而达不到良好的冷冻效果[11]。有研究表明，低活力的精子核DNA冷冻耐受性比高活力的精子差，其核DNA在冷冻过程中容易受损[12]。精子染色质异常或DNA受损均可导致受精失败、胚胎发育异常、妊娠率降低[13]。有研究证实，快速冷冻不会导致细胞内大量冰晶的形成，从而降低对精子的损伤[14]。本中心所使用的微量冷冻法，采用快速冷冻法，将精子在液氮上方停留5～8 min后投入液氮内保存，这种方法的冷冻速率高于常规冷冻，虽稍低于直接投入液氮内的冷冻方式，但其同时配合以麦管作为冷冻载体的小体积冷冻法还提高了冷冻速率。此外，严重少弱精子症患者的精子数目少、活力弱，冷冻过程则进一步降低精子的数目及活力，常规冷冻复苏后精子活动率及回收率低[15]。刘项等[16]对中重度少弱精子症患者的冻融精子与新鲜精子的ICSI临床结局进行比较，发现常规的冷冻方法其可利用胚胎率和优胚率显著低于新鲜对照组，提示常规冷冻方法可能并不适合严重少弱精子症患者的精子冷冻。本中心采用的复温是置于37℃液体中以达到快速复温的目的，避免再生冰晶和脱玻化，能最大程度保证精子活动率及回收率。目前在进行ICSI操作时，ICSI皿中的精子滴我们采用的是回行滴，尽量选用游至相对干净处的精子，在聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Irvine，美国)内进行清洗，防止将精子冷冻液带入卵母细胞浆内。本中心严重少弱精子症冻融精子组与新鲜精子组的受精率、卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎率、生化妊娠率、临床妊娠率、流产率比较均无统计学差异，提示微量精子冷冻并不影响少弱精子症患者的妊娠结局。

但因为严重少弱精子症患者的病因各异，主要由遗传因素和环境因素引起，在研究中应考虑到染色体异常的因素，本研究中未进行患者内分泌激素水平检查和染色体分析，可能对研究结果造成一定影响。后续研究应进一步完善实验设计，扩大样本量进行深入分析。

综上所述，严重少弱精子症患者微量精子冻融后行ICSI可以获得与新鲜精子ICSI相似的妊娠结局，但仍需后续更大样本量的前瞻性研究加以探讨验证。

【参 考 文 献】

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