基于单光子计数的水稻真菌病害孢子活性检测的方法

冯冠潮

摘要：本项目通过单光子计数器对水稻真菌病害孢子活性进行检测，通过使用微流控芯片配合单光子计数器简化原有检测过程，缩短检测周期，达到对于水稻病害包子的早期及时预测，具有巨大的经济效益和项目前景

关键词：水稻真菌病害；单光子计数；缩短检测周期

稻作为世界主要粮食作物之一。中国水稻播种面占全国粮食作物的1/3，而稻谷产量则粮食总产量的45%，同时我国65%以上的人口以大米为主食。水稻的产量又与水稻病害息息相关，稻瘟病、纹枯病和白叶枯病并称水稻三大病害，每年对水稻生产造成巨大损失，其中稻瘟病、纹枯病都是由真菌引起。据统计，在现有防治水平下，全国平均每年水稻因水稻病害引起的减产达400-500万吨，所以对由真菌引起的水稻病害的孢子检测与预防工作刻不容缓。

针对上述水稻病害即稻瘟病、纹枯病，研究表明，这两种病害都是由真菌引起，同时孢子传播途径都是空气传播。因此，对这两类病害的最佳检测手段就是对植株周边空气中致病孢子的浓度和活性进行检测。现阶段，对植物取样孢子活性的传统检测需要先将取得的样品进行杀菌纯化后经行培养，如点植法、稀释平板计数法等，然后通过化学染色法如亚甲基蓝[8]或通过荧光素二乙酸酯等进行染色，再进行如直接显微镜记数法、最近似数测定法等进行计数测量得到孢子活性。这类方法虽然实验过程简单，成本低廉，对设备要求较低，但是测量周期较长，无法对水稻病害进行早期检测和预防。随着现代医学免疫学和基因技术的发展，对孢子活性的检测也产生了很多多样化的手段，如多聚酶链式反应（PCR）、酶联免疫法（ELISA）、直接表面荧光滤膜计数技术（DEFT）等[4，8]。由于水稻致病真菌的气传孢子具有浓度极低，孢子尺寸极小且样本中杂菌、杂质含量高的特，点现有检测手段虽然可以准确测定孢子个体数量变化，但是由于检测试剂如底物、辅酶的限制，对被测对象存在检测的盲目性和滞后性。而且为了提高检测结果，避免外界干扰，需要严格的实验室环境和复杂的实验过程，导致较高的设备需求和检测成本。

光子计数器（PMT）是一种基于直接探测量子限理论的极微弱光脉冲检测设备。它利用光电倍增管的单光子检测技术，通过对电子计数器鉴别并测量单位时间内的光子数，从而检测离散微弱光脉冲信号功率[6]（见图2）。由于光子计数器对微弱光照的敏感性，目前国内外单光子计数法在微弱荧光生物测量方面有着较为广泛运用，如通过基于时间相关单光子计数法测量生物组织光学参数[5]（见图3）利用时间相关单光子计数法测量人体癌细胞的荧光光谱特性[10，11]。但是，目前的国内单光子计数器对于孢子活性的荧光检测方面研究尚存较大空白，首先并无可以直接进行检测的针对性装备，其次亦无对荧光强度与孢子活性间适配的数学模型。而且现存对其他对象的检测方案对待测样本的要求较高，需要经过一定的预处理过程，对实验设备有较高要求；同时检测方案多为通过光子的散射和反射来间接测量样本，后期数据处理过程较为复杂，计算量大。

本项目拟采用以下技术思路，技术路线如图所示：

光传孢子的特性以及分布模型选择合适的微流控材料并设计特定的微流控芯片，设计并构建光学通路，并创建基于单光子计数器的荧光检测平台，用荧光检测平台对目标孢子进行荧光检测。通过实验数据结合已有文献资料建立数学模型，并用该数学模型进行软件仿真以求复现数据。

本实验主要研究内容：

（1）、解决微流控芯片芯片对于气传孢子的纯化、富集问题，寻找合适的对水稻气传孢子具有靶向检测效果的荧光试剂；

（2）、解决单光子计数装置与微流控芯片光学耦合的問题；

（3）、解决病害种类及程度与荧光光子吸收量间的模型关系问题；

平台创建构思：

（1）、解决微流控芯片芯片对于气传孢子的纯化、富集问题，寻找合适的对水稻气传孢子具有靶向检测效果的荧光试剂；

（2）、解决单光子计数装置与微流控芯片光学耦合的问题；

（3）、解决病害种类及程度与荧光光子吸收量间的模型关系问题；

3、针对数学模型的建立问题：、

（1）、根据前期建立的孢子生化反应模型和物理空间分布特性模型结合实验原始数据建立先期模型；

（2）、通过实验结果与数学模型分析结果进行比对，修正数学模型。

（作者单位：江苏大学）