橡胶树叶片原生质体分离条件的优化

戴雪梅 杨先锋 辛士超 成镜 彭素娜 华玉伟

摘 要 分别以橡胶树GT1种子实生苗古铜期、变色期、淡绿期和稳定期4个不同发育阶段的叶片为材料进行原生质体的酶解分离研究，同时分析比较不同酶组合、酶解时间和甘露醇浓度等主要因素对橡胶树叶片原生质体产量和活力的影响，建立高效稳定的橡胶树叶片原生质体分离体系，为进行橡胶树外源基因瞬时表达及CRISPR基因编辑等研究快速提供高产优质的原生质体。结果表明：在同等条件下，变色期叶片的原生质体产量和活力最高，分别为14.8 ×107个/g FW和97.3%；其次为古铜期叶片，可达到8.6×107个/g FW和95.2%；淡绿期和稳定期叶片原生质体的产量非常低，活力也相对较低，分别仅有3.4 ×105个/g FW和89.5%、7.2 ×104个/g FW和80.6%。单因素实验结果表明，最适合变色期叶片原生质体分离的条件为：酶组合为2%纤维素酶+0.6%离析酶、酶解时间为6 h、甘露醇浓度为0.6 mol/L，此时橡胶树叶肉原生质体的产量可高达19.7×107个/g FW，活力约为97.6%。

关键词 橡胶树 ；叶片发育阶段 ；原生质体分离

中图分类号 S794.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.011

Abstract The leaves of rubber tree （Hevea brasiliensis Mull. Arg） at the bronze phase， color-changing phase， light green phase and stable phase were used as materials for protoplast isolation. The effects of some major factors such as enzymatic combination， digestion time and concentration of mannitol on the production and viability of protoplasts were analyzed in order to establish an efficient system for protoplast isolation and provide protoplasts for transient exogenous gene expression of and CRISPR genome editing of rubber tree. The results showed that the leaves at the color-changing phase under the same isolation conditions had the highest yield and viability of mesophyll protoplasts （14.8×107 protoplasts/g FW and 97.3%， respectively）， followed by the leaves at the bronze phase （8.6×107 protoplasts/g FW and a viability of 95.2%）， while the leaves at the light green phase and stable phase had very low protoplast yield and relatively low viability （3.4×105 protoplasts/g FW and 89.5%； 7.2×104 protoplasts/g FW and 80.6%， respectively）. The single factor experimental results showed that the optimal conditions for protoplast isolation were 2% cellulase R-10+0.6% macerozyme R-10 for the enzymatic combination， 6 h for the digestion time， and 0.6 mol/L for the concentration of mannitol. Under these optimal conditions the yield of protoplasts of rubber tree leaves could be up to 19.7×107 protoplasts/g FW with viability of 97.6%.

Keywords Hevea brasiliensis Mull. Arg ； leaf development stage ； protoplast isolation

巴西橡膠树（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）是重要的热带经济作物，所产的天然橡胶是四大战略物资之一。随着分子生物学和功能基因组学的迅速发展，转基因育种已成为多种作物种质改良的有效途径。中国于2016年完成较高质量的橡胶树全基因组测序工作，并通过基因组的分析对橡胶树胶乳产量及物种适应性提出了新的认识[1]，对今后橡胶树分子生物学研究及基因工程育种起了极大的推动作用。但目前橡胶树转基因技术尚不成熟，转化效率偏低，且由于生长周期较长，转入的目标基因无法在橡胶树体内得到快速的验证。此外，橡胶树转基因起始材料主要为愈伤组织和体细胞胚等多细胞组织或器官[2-3]，再生株系易产生嵌合体，导入的目标基因在后代培育中易发生分离而难于稳定遗传。利用高效的原生质体瞬时表达体系可以快速对目标基因进行表达水平和部位分析及功能的初步验证，且转化后经原生质体培养获得的再生植株属于单细胞起源，不存在嵌合体现象，可节省大量繁琐的后续筛选工作，从而缩短培育周期、加快育种进程。

然而目前大多利用烟草、拟南芥等异源的模式植物原生质体对橡胶树中克隆分离的目标基因进行表达分析，无法保证研究结果的准确性，关于利用橡胶树自身细胞进行外源基因瞬时表达的研究报道非常少。究其原因，在于尚未寻找到一个合适的可用于建立高效瞬时表达体系的橡胶树原生质体分离材料及稳定高效的制备技术体系。虽然Zhang等[4]报道称，针对橡胶树热研7-33-97实生苗淡绿期叶片，可通过酶解获得高产量高活力的原生质体，并以此建立了相对高效的橡胶树原生质体瞬时表达体系。但笔者在研究过程中采用该文献描述的方法进行实验时发现，淡绿期叶片经酶解后获得的原生质体产量和活力均相对较低，难以进行下一步的基因转化及其它应用研究。为了解决这个问题，有必要建立一个完善的橡胶树高产优质原生质体的制备方法，用于构建高效的橡胶树原生质体瞬时表达体系，使得从全基因组调出的一些重要基因可以通过该体系在橡胶树体内表达，以便对其进行分析和功能鉴定。

本研究以最容易获得的橡胶树GT1种子实生苗为研究对象，分别选取古铜期、变色期、淡绿期和稳定期4个不同发育阶段的叶片为起始材料，进行原生质体酶解分离条件的摸索和优化，分析比较不同酶组合、酶解时间和甘露醇浓度3个主要因素对橡胶树叶片原生质体产量和活力的影响，以建立一个稳定高效的橡胶树叶片原生质体分离技术体系，为目标基因在橡胶树自身体内的瞬时表达分析及功能验证快速提供大量高活力的原生质体。

1 材料与方法

1.1 材料

橡胶树GT1种子实生苗采自海南省儋州市中国热带农业科学院橡胶树种质圃，以4个不同发育阶段的叶片作为原生质体分离的起始材料。

纤维素酶R-10、离析酶R-10均购自日本Yakult Honsha公司；PEG 4000、甘露醇、KCl、CaCl2、MES等試剂药品均购自Sigma公司。

实验所用W5溶液的配制参照Yoo等[5]描述的方法，成分为：2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 叶片原生质体的分离和纯化

分别选取橡胶树GT1种子实生苗古铜期、变色期、淡绿期和稳定期4个时期的叶片各1 g（鲜重），立刻转入0.6 mol/L甘露醇中浸泡10 min；用吉列刀片避开主叶脉将叶片切成0.5～1 mm宽的细长条，放入含10 mL酶液（1.5%纤维素酶，0.5%离析酶，0.5 mol/L甘露醇，204 mmol/L KCl，67 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MES，0.1% BSA，pH 5.7）的100 mL三角瓶中，抽真空后置于28℃暗培养室，在60 r/min摇床上振荡酶解5 h；终止反应，用等体积的W5溶液稀释，并依次通过250和500目的不锈钢滤网；将滤液转入50 mL圆底离心管中，以1 000 r/min离心3 min，弃上清，用W5溶液将沉淀漂洗2次，在相同条件下离心收集原生质体并用1 mL W5溶液重悬，取少量原生质体悬液进行产量和活力的测定。

1.2.2 酶组合单因素实验

以上述酶解后原生质体产量最高的叶片为材料（以下实验同），在0.6 mol/L甘露醇中浸泡10 min后用吉列刀片除去主叶脉，将其切成0.5～1 mm宽的细长条，分别转入9种含不同浓度纤维素酶和离析酶的酶组合液中（表1）；抽真空后置于28℃暗培养室，于摇床上以60 r/min分别振荡酶解5 h，过滤漂洗纯化后用1 mL W5溶液重悬，分别测定原生质体的产量和活力。

1.2.3 酶解时间单因素实验

采用上述获得最高原生质体产量的酶组合，在28℃暗培养条件下，于60 r/min摇床上分别对叶片切条进行2、4、6和8 h酶解处理，过滤纯化后用1 mL W5溶液重悬，比较不同酶解时间对原生质体产量和活力的影响。

1.2.4 甘露醇浓度单因素实验

采用最佳的酶组合，在配制酶液时分别加入0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L甘露醇，分别对叶片切条进行酶解处理，时间为上述获得的最佳酶解时间；过滤纯化后用1 mL W5溶液重悬，比较不同渗透压对原生质体产量和活力的影响。

1.2.5 原生质体产量和活力的测定

原生质体的产量采用血球计数板（规格为25格×16格）进行测定。取少量原生质体悬液，滴入血球计数板计数室中，在光学显微镜下统计四角及中间5个中方格（共80个小方格）的原生质体数。按照以下公式计算：原生质体总数（个/g FW）=80个小方格原生质体数/80×400×104×稀释倍数。每个样品重复3次。

原生质体的活力采用FDA染色法[6]进行荧光观察鉴定。将新分离的原生质体用0.01%的FDA染色5 min后，在荧光显微镜下统计发绿色荧光的存活原生质体数及总原生质体数，随机观察3个视野取其平均值，并采用以下公式进行计算：原生质体活性=（存活原生质体数/总原生质体数）×100%。每个样品重复3次。

1.2.6 数据处理

用Excel 2007进行数据整理及制图，用DPS 7.55进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 叶片不同发育时期对原生质体产量和活力的影响

从表2和图1可以看出，古铜期、变色期、淡绿期和稳定期这4个时期的叶片在相同酶解条件下原生质体的产量和活力均存在显著差异，其中产量和活力最高的是变色期叶片，分别达到14.8×107个/g FW和97.3%；古铜期叶片虽然极易被酶消化，但可能由于其比较幼嫩脆弱，在酶解过程中细胞较易破裂，导致活力和总体产量均略低于变色期叶片；而淡绿期到稳定期叶片逐渐木质化，细胞壁不易被酶消化，因此产量依次显著降低，尤其是稳定期叶片由于已完全硬化，酶解非常困难，而且所得原生质体在显微镜下可见较多纤维碎片，细胞活力也只有80%左右。结果表明处于变色期的叶片是用来分离高产量高活力原生质体的最佳起始材料。

2.2 酶组合对叶片原生质体产量和活力的影响

以变色期叶片为材料，在甘露醇浓度为0.5 mol/L、酶解时间为5 h的条件下，分析比较纤维素酶和离析酶不同组合浓度对原生质体产量和活力的影响。从图2可以看出，纤维素酶在叶片原生质体的分离过程中起主要作用。随着纤维素酶浓度的升高，原生质体的产量显著增加，但当纤维素酶浓度升高到3%时，原生质体的活性急剧下降，导致原生质体的产量亦显著下降；离析酶浓度对原生质体的产量和活性也有一定的影响，在纤维素酶浓度为2%时，随着离析酶浓度的升高原生质体产量有所增加，继续升高其浓度，产量变化趋势不明显，但活性略有所下降。最适合变色期叶片原生质体分离的酶组合是2%纤维素酶+0.6%离析酶，此时原生质体的产量可高达14.2 ×107个/g FW。

2.3 酶解时间对叶片原生质体产量和活力的影响

在酶组合为2%纤维素酶+0.6%离析酶、甘露醇浓度为0.5 mol/L的条件下，将变色期叶片分别酶解2、4、6、8 h，分析比较不同酶解时间对原生质体产量和活力的影响。结果如图3所示，酶解时间在6 h以内时，原生质体的产量随着酶解时间的增加显著提高，之后呈下降趋势；细胞活性在前6 h内差异不明显，均可达95%以上，之后急剧下降。综合考虑原生质体的产量和活力，最佳的酶解时间为6 h，此时，原生质体的产量可达到17.8 ×107个/g FW。

2.4 甘露醇浓度对叶片原生质体产量和活力的影响

在酶组合为2%纤维素酶+0.6%离析酶、酶解时间为6 h、甘露醇浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的条件下对变色期叶片进行原生质体的分离和活性检测。結果如图4所示，甘露醇浓度在0.2～0.6 mol/L时，原生质体的产量和活力均随着甘露醇浓度的增加而显著升高；当甘露醇浓度升至0.8 mol/L时，原生质体的产量和活力均呈现下降趋势。结果表明低渗和高渗环境均不利于原生质体的分离，酶液中最适合橡胶树叶片原生质体分离的甘露醇使用浓度为0.6 mol/L，此时其产量和活力均达到最高，分别为19.7 ×107个/g FW和97.6%。

3 讨论

离体培养的愈伤组织、悬浮细胞、体细胞胚及植物的各个活体器官，如根、茎、叶、花、果实、种子等均可作为原生质体分离的起始材料。由于获得愈伤组织和悬浮细胞等离体组织所需的时间较长且通常在暗室培养，不利于研究与叶绿体相关的目标基因的表达及定位分析，而叶片是可以最快速获取的植物材料，且由于其含有丰富的叶绿素，新鲜的叶肉原生质体通常具有光合成活性[7]，非常适合用来鉴定与叶绿体相关的基因功能及研究光和叶绿体作用的相关过程[8]。因此，叶片是许多植物用于分离原生质体的首选材料。

根据发育时间及形态颜色的差异，橡胶树叶片从萌发到成熟可划分为A、B、C、D 4个阶段[9-10]，依次命名为古铜期、变色期、淡绿期和稳定期[11]。其中古铜期、变色期和淡绿期叶片几乎不含木质素，但稳定期的叶片由于木质化而变硬[10]。不同时期的叶片经酶解后所得原生质体的产量和活性均有较大差别。Zhang等[4]分别以古铜期、变色期和淡绿期3个时期的叶片为起始材料进行原生质体的分离和活性检测，指出淡绿期叶片经酶解后能得到最高产量和活性的原生质体，古铜期叶片原生质体的产量最低，变色期叶片原生质体的产量略高于古铜期叶片，但仍远低于淡绿期叶片。而本研究结果与之相差较大，数据显示相同酶解条件下获得最高原生质体产量和活性的是变色期叶片，古铜期的产量和活性均仅略低于变色期叶片，淡绿期和稳定期叶片的原生质体产量依次显著下降，而且这2个时期叶片分离的原生质体在显微镜下可见较多细胞碎片和残渣。表明变色期叶片是获得高质量原生质体的最佳来源，其次为古铜期叶片，淡绿期和稳定期获得的原生质体产量不高且质量较差，推测这是由于对橡胶树叶片发育阶段的人为划分有误差所致。

植物原生质体是去除细胞壁后仅由质膜包围的裸露细胞，具有对外在环境敏感、体积小、单次处理量大等特点，且从制备到检测的周期短，一般只需要2～3 d。因此，利用原生质体进行外源基因的瞬时转化技术被广泛应用于外源基因表达[12]、蛋白亚细胞定位[13]、蛋白互作[14]、启动子分析[15]及信号传导通路[16]等领域的研究。此外，近几年来兴起的CRISPR新型基因组编辑技术[17]，亦依赖于高效的原生质体瞬时表达技术。目前，相关研究者已分别在拟南芥[18]、烟草[19]、玉米[20]、小麦和大麦[21]、水稻[22]等重要模式植物和作物中建立了成熟的原生质体瞬时表达体系。在橡胶树中，于晓玲等[23]以橡胶树热研7-33-97双核期花药诱导的松散愈伤组织为材料酶解分离原生质体，采用电击法将含有红色荧光蛋白基因（RFP）的植物表达载体pA7-RFP转入橡胶树原生质体中，并通过激光共聚焦显微镜观察到个别细胞中有RFP蛋白的表达；Zhang等[4]在分析比较了古铜期、变色期和淡绿期3个时期的叶片分离的原生质体产量和活性后，选择产量和活力最高的淡绿期叶片原生质体进行GFP基因的转化，建立了一个相对高效的橡胶树原生质体瞬时表达体系，转化效率可达50%以上。笔者也尝试了对橡胶树4个时期叶片分离的原生质体分别进行GFP基因的转化，结果显示，从变色期叶片中分离得到的原生质体产量和活性最高，其转化效率也最高（数据未发表）。由此可见，原生质体瞬时转化效率不仅与材料来源有关，而且与其产量和活性呈正相关。

用于植物原生质体分离的酶主要有纤维素酶、半纤维素酶、离析酶、果胶酶、蜗牛酶等。所用酶种类和酶浓度均随着物种及酶解材料的不同而略有差异。叶片原生质体的分离大多采用纤维素酶和离析酶，本研究在前人研究基础上对这2种酶的最适浓度进行了摸索。同时，对影响原生质体产量和活性的另外2个重要因素即酶解时间和甘露醇使用浓度进行了优化，建立了一个稳定高效的橡胶树叶片原生质体制备技术体系，可为目标基因的瞬时表达研究及功能分析快速提供大量高活力的原生质体。

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