假臭草和胜红蓟提取物抑菌活性及稳定性研究

周怡 陈雅婷 王奇志 余岩

摘 要 为了更好地利用入侵植物假臭草[Praxelis clematidea（Griseb.）R.M. King & H. Rob.]与胜红蓟（Ageratum conyzoides L.），本文筛选了2种入侵植物不同乙醇浓度提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌的最适提取浓度，检测抑菌活性高的提取物的最低抑制浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低杀死浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），并评价其抑菌的热稳定性、紫外光辐射稳定性和氧化稳定性。结果表明：假臭草茎叶的70%乙醇提取物[抑菌圈直径（34.70±0.93）mm]及胜红蓟叶的50%乙醇提取物[抑菌圈直径（30.95±1.30）mm]抑菌活性高，MIC值分别是0.78和3.13 mg/mL，MBC值是 3.13和25.00 mg/mL，并且抑菌活性具有较好的热稳定性和紫外光辐射稳定性，假臭草提取物的氧化稳定性优于胜红蓟提取物。对金黄色葡萄球菌抑菌活性高的2种入侵植物提取物具有一定的抑菌活性稳定性，在开发植物源抑菌剂方面有潜在应用价值。

关键词 假臭草 ；胜红蓟 ；金黄色葡萄球菌 ；抑菌活性 ；抑菌稳定性

中图分类号 S482.2+92 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.017

Abstract Invasive plants Praxelis clematidea （Griseb.） R.M. King & H. Rob. and Ageratum conyzoides L. were extracted with different concentrations of ethanol to observe their activities against Staphylococcus aureus in order to utilize the invasive plants. The optimum extraction concentrations of these 2 invasive plants were screened and the minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of the extracts with high antibacterial activity were detected. The thermal stability， UV stability and oxidation stability of the extracts against the bacterium S. Aureus were evaluated. The results show that the 70% ethanol extract [inhibition zone diameter （34.70±0.93）mm] of P. clematidea and 50% ethanol extract [inhibition zone diameter （30.95±1.30）mm] of A. conyzoides had the highest antibacterial activity with their MIC values being 0.78 mg/mL and 3.13 mg/mL， and the MBC value 3.13 mg/mL and 25.00 mg/mL， respectively. The antibacterial activity of the extracts had a good thermal and UV stability， and the P. clematidea extract had a higher oxidation stability than the A. conyzoides extract. The ethanol extracts of the 2 invasive plants with high antibacterial activity against S. aureus demonstrates antibacterial stability， suggesting the potential for development of plant-derived antimicrobial agents by using these 2 invasive plants in the future.

Keywords Praxelis clematidea ； Ageratum conyzoides ； Staphylococcus aureus ； antibacterial activity ； antibacterial stability

假臭草[Praxelis clematidea（Griseb.）R.M. King & H. Rob.]和胜红蓟（Ageratum conyzoides L.）是中国南方常见的恶性入侵杂草[1-2]，对农林牧业及生物多样性都造成严重的影响，目前对其防治措施主要以拔除和噴施化学除草剂为主，防治成本高且对环境污染严重[3]。因此对假臭草资源化利用是对其防除的新策略。

尽管假臭草和胜红蓟的主要化学成分有明显差异[4-10]，但研究发现，2种入侵植物对多种病原微生物都具有一定的抑菌活性。Wang等[11]发现，假臭草精油对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和辣椒疫霉菌（Phytopthora capsici）具有一定抑制作用；Oliveira-filho等[12]研究结果表明，假臭草乙醇提取物对白色念珠菌（Candida albicans）有显著抑制作用；Filho等[6]从假臭草中分离得到的5，7，4′-三甲氧基黄酮对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大肠杆菌（Escherichia coli）均具有抑菌活性；孔垂华等[13]研究表明，胜红蓟对水稻纹枯病（Thanatephorus cucumeris）和花瓜灰霉病（Botrytis cinerea）有一定抑制作用；Okunade 等[14]发现，胜红蓟对产黄青霉（Penicillium chrysogenum）和蔓枯病菌（Didymella bryoniae）均有抑制活性；Nogueira 等[15]研究发现，胜红蓟挥发油可以抑制黄曲霉毒素B1的产生；Adetutu 等[16]在对胜红蓟乙醇提取物的研究过程中发现，其对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑制活性。更有研究表明，假臭草和胜红蓟的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性较为明显[17]。综上所述，2种入侵植物资源丰富，是潜在植物源抑菌剂的来源，并且未有关于2种植物不同乙醇浓度提取物抑菌活性稳定性的报道。因此，本研究将进一步探索2种入侵植物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，首次筛选出乙醇提取物抑菌的最适浓度，并检测抑菌活性高的提取物的最低抑制浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低杀死浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），评价其抑菌活性的稳定性（热、紫外光辐射和氧化稳定性），为更好的利用2种入侵植物资源，实现变废为宝提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

将假臭草的茎叶鲜样和胜红蓟的叶部鲜样冲洗干净剪段后放入45℃鼓风干燥箱，干燥3 d后，磨粉，过40目筛，放入塑封袋备用。

供试菌种：金黄色葡萄球菌（S. aureus）。

主要仪器和试剂：YB-2000A型高速多功能粉碎机，浙江康永市速锋工贸有限公司；N-110型旋转蒸发仪，EYELA； SW-CJ-2F型超净工作台，苏州净化；SHP-250型恒温培养箱，上海精宏实验设备公司；UV-1200型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；细菌滤器，厦门绿茵试剂有限公司；中国药典标准牛津杯，厦门绿茵试剂有限公司；无水乙醇，AR，国药集团有限公司；吐温-80，AR，厦门泰京生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制备

称取植物干粉40 g，按料液比1∶5（g/mL），用0、30%、50%、70%和95%不同浓度乙醇浸泡12 h后减压抽滤，滤渣用等体积的溶剂浸泡，重复2次；合并3次所得滤液，35～45℃减压旋蒸，得到有机提取物浸膏，浸膏用40 mL 50%乙醇和20%吐温-80 混合溶液溶解稀释，使其浓度为1 g/mL，对照溶剂为50%乙醇和20%吐温-80的混合液。

1.2.2 抑菌活性的测定

采用牛津杯法[18]对不同乙醇浓度提取物的抑菌活性进行测定。向每个牛津杯中加入150 μL不同浓度乙醇提取物，对照溶剂为50%乙醇和20%吐温-80的混合液，于37℃恒温培养箱培养24 h后，观察细菌生长情况，采用十字交叉法，统计抑菌圈直径，每组实验重复3次。筛选出抑菌活性高的提取物，以备后续实验使用。

1.2.3 MIC和MBC测定

取抑菌活性高的提取物，采用试管二倍递减稀释法[19]置入10支灭菌试管中的浓度分别为：50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20和0.10 mg/mL，每只试管中加入浓度为1×108 cfu/mL的细菌菌悬液50 μL，对照组加入等量无菌水，37℃的摇床培养24 h后，每管吸出2 mL在紫外可见分光光度计上测定吸光值，若处理组和对照组的吸光度值为0，则认为培养基中完全没有菌生长，未长菌培养基中最低的浓度作为提取物的最低抑制浓度（MIC），将上述最低抑制浓度培养物继续在37℃恒温培养箱中培养24～48 h，求出最低杀死浓度（MBC）。

1.2.4 稳定性评价

对抑菌活性高的提取物的热稳定性、紫外光辐射稳定性和氧化稳定性进行测定。

1.2.4.1 热稳定性

取等量浓度为200 mg/mL的提取物分别置于4、40、60、80和100℃水浴及121℃湿热条件下热处理20 min。采用1.2.2牛津杯法测定不同处理后提取物的抑菌活性。

1.2.4.2 紫外光辐射稳定性

将浸泡有提取物的滤纸片置入超净工作台上吹干后，使用紫外灯照射5、10、15、20和25 min后贴在涂过供试菌的平板上。倒置放在恒温箱中，37℃培养18～24 h后测定抑菌活性。

1.2.4.3 氧化稳定性

取提取物200 mg放于2 mL离心管中，在室温条件下暴露于空气中5、10、24、48和72 h后，用20%吐温80溶液稀释至1 mL。采用1.2.2牛津杯法测定不同处理后提取物的抑菌活性。

1.2.5 数据统计分析

采用SPSS 22.0软件进行数据的统计与分析，Origin9.0软件作图。抑菌圈直径均为3次重复实验的平均值±标准偏差。采用最小显著差法（LSD）多重比较进行显著性分析（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同提取物的抑菌活性

如图1所示，假臭草和胜红蓟不同浓度乙醇提取物均对金黄色葡萄球菌具有抑制活性。其中假臭草70%乙醇提取物（抑菌圈直径34.70±0.93 mm）和胜红蓟50%乙醇提取物（抑菌圈直径30.95±1.30 mm）抑菌活性最好。对照溶剂对金黄色葡萄球菌无抑菌活性。

2.2 MIC和MBC測定

如表1所示，假臭草茎叶70%乙醇的提取物不同浓度（50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56和0.78 mg/mL）都没有菌落生长，因此提取物对供试菌的MIC为0.78 mg/mL，最后结果检测出MBC为3.13 mg/mL。

如表2所示，胜红蓟叶50%乙醇提取物物对供试菌的MIC为3.13 mg/mL，最后结果检测出MBC为25.00 mg/mL。假臭草提取物对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均小于胜红蓟，因此假臭草提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性要高于胜红蓟。

2.3 稳定性研究

假臭草茎叶70%乙醇提取物和胜红蓟叶50%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的稳定性研究结果如下。

2.3.1 热处理对提取物抑菌稳定性的影响

如图2所示，不同温度处理后的假臭草提取物的抑菌圈直径差异均不显著（p>0.05），最小和最大抑菌圈直径分别为（21.53±0.85）mm和（23.10±0.13）mm，假臭草提取物抑菌活性物质并没有因温度受到很大影响，说明假臭草抑菌活性物质耐高温，具有很好的抑菌热稳定性。胜红蓟提取物经过不同的温度处理后，当温度低于75 ℃时，不同温度处理的提取物抑菌圈直径没有显著差异（p>0.05）；处理温度为100 ℃时，抑菌圈达到最大值（12.37±0.71）mm，处理温度为4 ℃时，抑菌圈最小为（11.24±0.18）mm，二者差异显著（p<0.05）。低温（4℃）和常温条件对假臭草提取物抑菌活性物质并没有影响。在高温条件下（100℃和121℃）胜红蓟提取物抑菌活性并没有减弱，二者差异不显著（p>0.05），说明胜红蓟抑菌活性物质耐高温，具有一定的热稳定性。

2.3.2 紫外光辐射对提取物抑菌稳定性的影响

如图3 所示，假臭草提取物抑菌稳定性受紫外辐射的影响，随着紫外处理时间的增加，抑菌圈直径有逐渐减小的趋势，抑菌活性降低，当紫外处理5 min时，抑菌活性最好，抑菌圈直径为（24.10±0.58）mm；25 min时抑菌圈直徑最小为（21.05±0.61）mm，二者之间差异显著（p<0.05）。胜红蓟提取物经过紫外辐射不同时间后抑菌圈差异均不显著（p>0.05），抑菌圈直径最大值和最小值分别为（13.43±0.81）mm和（12.34±1.24）mm。假臭草提取物抑菌稳定性受紫外辐射影响较大，胜红蓟提取物具有一定的紫外辐射稳定性。

2.3.3 氧化处理对提取物抑菌稳定性的影响

如图4所示，假臭草提取物在经过不同的氧化时间处理后对金黄色葡萄球菌的抑菌活性总体呈减弱趋势。当提取物经氧化处理48 h后，抑菌活性相比之前显著降低（p<0.05），其最大和最小抑菌圈直径分别为（18.80±0.99）mm和（16.44±0.49）mm。氧化处理对胜红蓟提取物抑菌稳定性影响较大，当氧化处理时间小于48 h时，提取物抑菌圈直径显著差异（p<0.05），其最大和最小抑菌圈直径分别为（14.34±0.47）m和（10.17±0.38）mm。结果显示，长时间氧化处理后会对假臭草提取物抑菌活性产生一定影响，而胜红蓟提取物抗氧化能力较差。

3 结论与讨论

3.1 结论

研究结果显示：假臭草和胜红蓟抑制金黄色葡萄球菌的粗提物的最佳乙醇提取浓度分别为70%和50%，并且假臭草的MIC值是0.78 mg/mL，MBC值是3.13 mg/mL；胜红蓟的MIC值是3.13 mg/mL，MBC值是25.00 mg/mL。在不同温度条件下热处理20 min后假臭草和胜红蓟的抑菌圈直径变化较小，说明假臭草和胜红蓟的提取物都有较强的热稳定性。使用紫外灯照射不同时间后显示，假臭草抑菌圈直径受紫外辐射影响有变小趋势，而胜红蓟抑菌活性未有明显变化，说明胜红蓟提取物具有较好的抗紫外辐射稳定性。当在室温条件下暴露于空气中不同时间后，假臭草的抑菌活性随时间延长会出现微弱下降趋势，胜红蓟抑菌活性下降趋势相对于假臭草较为明显，由此可见，假臭草提取物具有较好的抗氧化稳定性。

3.2 讨论

假臭草和胜红蓟是中国南方常见的恶性入侵杂草，为了实现对其资源化利用，本研究对其提取物抑菌的最适乙醇提取浓度、抑菌活性高的提取物的MIC、MBC以及抑菌的稳定性进行了探讨。另有研究表明，在同样使用牛津杯法和二倍稀释法测得乙醇提取物抑菌活性的条件下，五味子的MIC值为7 mg/mL，在使用滤纸片法和二倍稀释法测得乙醇提取物抑菌活性的条件下山胡椒的MIC值为0.062 5 g/mL[20-21]，与本实验的2种入侵植物相比其抑菌活性较弱。由此可见在抑菌活性方面相对于其他植物假臭草和胜红蓟更具优势，并且假臭草提取物具有较好的抑菌稳定性，不受保存温度的影响，方便储存，也比较利于进一步对其进行分离纯化，进行工业化开发利用；胜红蓟提取物具有较好的热稳定性和紫外光辐射稳定性，而抗氧化性一般。因此，在对胜红蓟的提取物储存时应尽量密封储藏，避免与空气过多接触。2种入侵植物假臭草和胜红蓟资源丰富，可以作为优质的天然抗菌植物资源，在植物源抑菌剂方面有良好的开发前景。

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