链霉菌N2粗提物对水稻抗性相关生理因子的影响

吴志明，鹿承建，杨 勇，龙 悦，章帅文，刘 群，李昆太

(江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西 南昌 330045)

水稻是全球超60%人口的重要粮食作物，但由真菌、细菌和病毒引发的植物病害正严重威胁着世界粮食安全[1]。例如，由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)和纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)而引发的水稻稻瘟病和纹枯病，已成为全球性的水稻病害[2]。然而，以人类健康和生态环境为代价的化学防治仍然是控制植物病害的主要手段。生物防治技术因良好的环境兼容与可持续性，被公认为现代防治植物病害的重要途径[3]。迄今为止，细菌、真菌和放线菌等拮抗微生物已成为生物防治的主力军，它们能通过直接产生抗生素、溶解酶或与病原真菌竞争营养和空间，诱导植物产生抗性发挥生防作用[4-6]。其中，诱导抗性(induced resistance,IR)是指利用生物或非生物因子刺激植物，激活其对逆境和病虫害的天然防御系统，诱导防御相关基因产物的形成[7]。比如，过氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)可催化木质素的形成，苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)参与植物防御素和酚类化合物的合成，β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanases,PR-2家族)和几丁质酶(chitinases,PR-3家族)等病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)可将病原真菌细胞壁降解并产生低聚物，进而诱导植物启动多种防御机制[8]。据报道，链霉菌可通过产多种次级代谢物拮抗病原菌，刺激植物启动防御系统，进而诱导系统抗性[9]。有研究发现[10]，经链霉菌MBR-37和 MBR-38处理后的杜鹃花能通过苯丙烷代谢途径激活防御反应，促进花青素的积累，降低感病指数。Zhao等[11]的研究表明，链霉菌HD-087发酵液不仅能直接抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长，增加胞内丙二醛含量，而且能有效提高黄瓜叶片的叶绿素与可溶性总糖的含量，显著激活POD、PAL和β-1,3葡聚糖酶的酶活，降低叶片的相对电导率。

Streptomycessp.N2是课题组Xu等[12]分离筛选到的一株能产新型抗真菌活性物质(3-甲基-3,5-氨基-4-烯-吡喃-2-酮，分子式为C6H7O2N，暂命名为农抗N2)的新种，此活性物质对立枯丝核菌、意大利青霉(Penicilliumitalicum)和稻瘟病菌等多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。本试验拟通过研究不同浓度农抗N2粗提物对水稻幼苗叶片活性氧清除系统、酚类物质代谢和病程相关蛋白等抗性相关生理因子的影响，旨在探明新型农抗N2粗提物诱导水稻幼苗提高抗性的作用机理，为新型微生物诱导剂——农抗N2的应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及其处理

链霉菌N2(Streptomycessp.N2)，分离自云南省昆明市西山国际森林公园。参考吴志明[13]等的方法制备链霉菌N2粗提物。用3%NaClO对淮两优608水稻种子表面消毒90 s，无菌水冲洗3～5次，30 ℃浸种24 h、催芽48 h后播种于育秧盆中，待长至三叶一心期时连根拔起，用流水冲净后浸于浓度为0.72,1.44,2.88 μg/mL的N2粗提物中，分别在处理24,48,60,72,96 h后取样，以等量无菌水处理为对照。

1.2 链霉菌N2粗提物对水稻的生物防效

1.2.1 N2粗提物对离体水稻的生物防效 用灭菌剪刀剪取健康且生理部位一致的50 d稻龄叶片，经不同浓度的N2粗提物浸泡15 min后，分别接种培养好的水稻纹枯病菌(Φ9 mm)；以未经粗提物浸泡只接种菌块为CK对照组，每个处理重复3次；30 ℃下光照培养2 d，参考文献[14]根据纹枯病斑占水稻叶片的面积比例将感病水稻分为0～4级(0级，叶片健康无症状；1级：1%～25%叶片发病；2级：26%～50%叶片发病；3级：51%～75%叶片发病；4级：76%以上叶片黄化，水渍状枯黄、溃烂)，统计发病情况，并按公式计算离体水稻叶片的病情指数。

病情指数=∑(病级叶片数×代表数值)/(叶片总数×发病最高级的代表数值)

(1)

1.2.2 农抗N2粗提物对活体水稻的生物防治 在盆栽水稻生长至第50天时(2株/盆)，预防实验中每隔12 h将不同浓度的N2粗提物(含0.05%吐温80)均匀喷施到水稻植株上，至有水珠流下为止，共喷施2次；24 h后将5 g培养好的纹枯病菌菌核均匀撒于水稻植株基部；治疗实验中参照预防实验先接种纹枯病菌核，24 h后喷药。以上实验组均置于湿度为80%的玻璃房(白天28 ℃；晚上20 ℃)中培养，以喷施蒸馏水为对照，15 d后观察水稻感病情况。

1.3 水稻抗病性相关生理指标的测定

1.3.1 N2粗提物对水稻幼苗活性氧清除系统的影响 采用羟胺氧化法[15]测定超氧阴离子自由基(·O2-)的含量，并稍有改进；按公式

·O2-含量(nmoL/g)=(n×VT/V1)/mFW

(2)

计算每克鲜质量样品每小时产生·O2-的含量；(其中：n为标曲计算所得NO2-的浓度/nmoL/L，VT为样品提取液总体积/mL，V1为测定时样品提取液体积/mL，mFW为样品鲜质量/g)。 采用二甲酚橙法[16]测定过氧化氢(H2O2)的含量，并稍有改进；按公式

H2O2(mmoL/g FW)=(n×VT×Vc /V1)/(mFW×1000)

(3)

计算每克鲜质量样品中所含H2O2的量；(其中：n为标准曲线上查的样品H2O2浓度，μmoL/L，V1为测定时样品提取液体积/mL，VT为样品提取液总体积/mL，Vc为萃取时取样体积，mFW为鲜质量/g)。 采用分光光度法[17-18]测定POD、CAT 和SOD的酶活，并稍有改进；以每分钟吸光值变化0.01为1个POD和CAT酶活单位，以抑制 NBT光还原50%为一个SOD酶活性单位U，酶活单位均为U/g FW。

1.3.2 N2粗提物对水稻幼苗酚类物质代谢的影响 采用Folin-Ciocalteu比色法[19]测定可溶性总酚含量，并稍有改进；并按公式

C(μg/g FW)= (A×V1)/(mFW×V2)

(4)

计算每克鲜质量样品中所含总酚的量(其中：V1为提取时样液体积/mL，V2为测定时样液用量/mL，mFW为样品鲜质量/g，A为标曲换算物质量/μg)。PPO和PAL参考文献[20]进行测定，以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活单位U/g FW。

1.3.3 N2粗提物对水稻幼苗病程相关蛋白的影响 采用考马斯亮蓝法测定可溶性总蛋白含量mg/g FW。参考文献[21-22]测定几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性，分别绘制标准曲线，以每小时分解胶体几丁质产生1 μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量定义为一个几丁质酶活单位U/g FW，以每小时分解昆布多糖产生100 μg葡萄糖的酶量为一个活性单位U/g FW。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2010、DPS 7.05、Adobe Photoshop CS5和Origin 9.0进行数据处理、绘图及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 N2粗提物对水稻的生物防效

观察不同处理组间的离体水稻发现(图1A)，随着N2粗提物浓度的提高，离体水稻叶片上的病斑逐渐减少，CK叶片受纹枯病的严重侵染，出现大面积水渍状病斑，而11.53 μg/mL组仅出现菌丝，未见病斑；同时，11.53 μg/mL中0级感病叶片数占同组处理叶片总数的56.56%，明显高于CK(图1B)；且N2粗提物处理后明显降低了离体叶片的病情指数，各组病情指数分别为80.56%、72.22%、47.22%、38.89%和30.56%(图1C)。此外，经N2粗提物预防和治疗处理后，活体水稻上纹枯病斑明显减少，且浓度越高防治效果越佳(图2)。由此可见，链霉菌N2粗提物可有效防止水稻纹枯病菌感染水稻。

2.2 N2粗提物对水稻幼苗活性氧清除系统的影响

由图3可知，不同浓度N2粗提物处理后水稻幼苗中·O2-和H2O2的含量均明显下降，变化趋势一致，经1.44和2.88 μg/mL处理48 h后·O2-含量显著降低了37.24%与30.50%，此时H2O2含量相比CK减少了19.40%和16.42%；直至96 h·O2-含量仍较CK组差异显著。此外，SOD随时间的延长活性先降后升，48 h后各处理组酶活开始显著被激活，于72 h时分别提高了37.98%、40.57和84.96%，显著高于CK组(图4A)；CAT虽经N2粗提物诱导后得到有效增强，但相比CK并不显著(图4B)；POD则迅速增强，且在72 h时相比CK显著提高了78.06%(图4C)。由此可见，水稻幼苗经N2粗提物处理后，迅速激活了SOD、CAT和POD酶的活性，体内·O2-和H2O2等活性氧含量被有效清除，减缓了水稻幼苗的氧化损伤，且高浓度处理持续效果相对更稳定。

图A中黑色箭头为典型纹枯病病斑，白色箭头为纹枯病菌丝，图B为感病级数百分比，图C为病情指数The black arrows in figure A is a typical disease lesion and the white arrow is referred to as the mycelium of the sheath blight，figure B as a percentage of the progression of a sense of disease,figure C is the disease index图1 农抗N2粗提物对离体水稻叶片的生物防效Fig.1 The degree of AN2 crude extract on detached rice leaves infected with sheath bligh

图中圆圈为典型纹枯病病斑，箭头所指为纹枯病菌核The circle in figure is typical of sheath blight lesion and the arrow refers to the nucleus of the Rhizoctonia solani图2 农抗N2粗提物对活体水稻的生物防治Fig.2 The infection of living-leaves by different concentration of AN2 crude extract

图中数据为3次重复的平均值±标准误；图中“*”表示经 Duncan氏新复极差法检验在同一时间点处理组与CK组间差异显著(P<0.05)，下同The results were means±SD (standard deviation) of triplicate determinations,the asterisk “*” in the same line indicate the significant (P<0.05) differences among treatments,similarly hereinafter 图3 农抗N2粗提物对水稻幼苗活性氧含量的影响Fig.3 Effect of AN2 crude extract on active oxygen content of rice

A：超氧化物歧化酶SOD；B：过氧化氢酶CAT；C：过氧化物酶PODA：Superoxide dismutase (SOD)，B：Catalase(CAT)，C：Peroxidase(POD)图4 农抗N2粗提物对水稻幼苗抗氧化酶活性的影响Fig.4 Effect of AN2 crude extract on antioxidant enzyme activities of rice

2.3 N2粗提物对水稻幼苗酚类物质代谢的影响

由图5可知，水稻幼苗经不同浓度N2粗提物处理后酚类物质代谢能力相比CK均显著提高，其中2.88 μg/mL组中的PPO(图5A)、总酚含量(图5B)和PAL(图5C)活性分别在72，48，24 h时达最大值，相比对照组分别提高了47.20%、43.55%和311.11%；相比2.88 μg/mL处理组，1.44 μg/mL处理与CK的变化趋势更一致，PAL、PPO活性和总酚含量在72h时分别高达(0.36±0.06)、(8.39±0.49)U/(g·min)和127.96±8.54 μg/g FW，差异显著。由此可见1.44 μg/mL N2粗提物能显著增强酚类物质代谢相关酶的活性，促进生物活性物质的产生，延缓水稻幼苗各项生理功能的衰弱，且其作用效果持续稳定，进一步提高了水稻的抗病性。

2.4 N2粗提物对水稻幼苗抗病相关蛋白的影响

由图6A可知，水稻幼苗中可溶性蛋白质的含量随时间的延长先略有降低后逐渐升高，48 h时各处理组的蛋白含量分别为(1.83±0.05)、(2.70±0.08)、(2.43±0.05)、(3.17±0.03)mg/g FW，且48 h至72 h间均显著高于CK组；同时由图6B可见，经1.44和2.88 μg/mL N2粗提物处理后几丁质酶活自24 h后逐渐提高，至96 h时相较CK分别提高了21.92%和30.80%，且差异显著；此外，β-1,3葡聚糖酶随处理时间的延长先升高后降低，在48 h时达最大，且浓度越高酶活越强(图6C),其中1.44和2.88 μg/mL与CK差异显著。综上可知，适宜浓度的N2粗提物能有效激活β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶等抗性相关酶活性，促进体内蛋白增加，以此增强水稻幼苗的抗病害能力，在48 h左右最强。

A：多酚氧化酶PPO；B：可溶性总酚；C：苯丙氨酸解氨酶PAL。图中数据为3次重复的平均值±标准误；图中不同小写字母表示经 Duncan氏新复极差法检验在同一时间点各处理组间差异显著(P<0.05)，下同A：Polyphenoloxidase (PPO)，B：Soluble total phenol，C：Phenylalnine ammonialyase(PAL).The results were means±SD(standard deviation) of triplicate determinations,the different lowercase letters in the same line indicate the significant (P<0.05) differences among treatments,similarly hereinafter图5 农抗N2粗提物对水稻幼苗酚类物质代谢的影响Fig.5 Effects of AN2 crude extract on metabolism of phenolic compounds in rice seedlings

A：可溶性蛋白；B：几丁质酶；C：β-1,3葡聚糖酶A：Soluble protein，B：Chitinase，C：β-1,3-glucanase图6 农抗N2粗提物对水稻幼苗抗性相关蛋白的影响Fig.6 Effect of AN2 crude extract on chitinase、β-1,3-glucanase and protein content of rice

3 讨 论

由立枯丝核菌引发的水稻纹枯病菌因宿主广泛，菌核长期存活于两季作物土壤中，且遗传变异性极强，致使水稻产量和质量大幅降低[23]。近年来，国内外研究者利用链霉菌防治水稻纹枯病的应用研究越来越多[24-25]。生防试验结果发现，11.53 μg/mL N2粗提物能显著抑制纹枯病菌在水稻叶片上形成菌核，降低水稻感染纹枯病的程度。超氧阴离子自由基(·O2-)和过氧化氢(H2O2)是生物体内活性氧ROS的重要组成部分，正常情况下，胞内ROS维持着相对稳定的平衡，当受到逆境、机体损伤等外界环境胁迫后ROS生产量超出自身清除能力，就会造成ROS水平升高，引起氧化应激[25-26]。而 SOD，CAT与POD三者协调组成的活性氧清除系统能有效清除植物体内的活性氧[27]。本试验表明，N2粗提物处理能迅速诱导激活SOD，CAT与POD组成的活性氧清除系统，防止水稻幼苗因·O2-和 H2O2含量过高而造成氧化损伤，且1.44和2.88 μg/mL处理组相比CK与0.72 μg/mL处理组效果更为明显。

PAL主要通过非氧化脱氨基作用将苯丙氨酸催化成反式肉桂醛，是酚类化合物积累的关键酶[28]。同时，PPO可参与苯丙烷类衍生物代谢以及类黄酮和生物碱的合成等生理生化过程，将酚类物质氧化形成高毒性的醌类物质抵御病原菌的入侵[29]。几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶是PRs蛋白家族中的重要成员，PRs蛋白在健康植物中不存在或表现微弱，当被诱导后则迅速产生并积累，因此认为大多诱导产生的植物抗性均与PRs蛋白有关，它参与植物的局部和系统诱导抗性[11,30]。实验结果表明，2.88 μg/mL N2粗提物处理水稻幼苗24 h后显著激活了PAL的活性，促进了总酚含量的积累，在48 h达到最高，随后诱导PPO酶活在72 h时最高，促使其充分将酚类物质进一步氧化成醌类物质，进而显著提高水稻幼苗的抗性。同时，可溶性总蛋白、几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活等病程相关蛋白均显著高于CK组，进一步提升了水稻幼苗降解病原真菌细胞壁的能力，有利于诱导植物启动防御机制。

综上所述，适宜浓度的N2粗提物可同时激活水稻幼苗活性氧清除系统，促进酚类物质代谢，增加病程相关蛋白含量等多种防御机制，协同提高水稻幼苗的抗性。但此研究局限于非生物因子诱导和酶活的测定，且是否为抗真菌活性物质农抗N2起主要诱导作用还有待进一步探索。同时，植物的诱导抗性并非单一因素作用，而是一项系统工程。因此农抗N2诱导植物抗病的作用机制有待更系统的研究。

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