气相色谱法测定食品中乙酰丙酸的方法验证

朱燕萍

选取市售酱油、饮料、饼干及奶粉样品，优化GB5009.252- 2016的前处理流程，改分液漏斗提取为离心管提取模式，改无水硫酸钠除水为滤头过滤，利用GC- FID，从专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限七个方面对食品中乙酰丙酸的测定进行方法验证。结果表明，线性范围在12.5mg/L- 750mg/L时，乙酰丙酸的线性相关系数r2 在0.9998- 0.9999之间，基质加标回收率在91.68% - 104.42%之间，相对标准偏差为0.12%- 5.64%。方法检出限为4.9 mg/kg，定量限为16.4 mg/kg，满足国标GB5009.252-2016的要求。

乙酰丙酸（果糖酸）是酸水解植物蛋白调味液中存在的一种特殊的有机酸成分，一般而言，纯酿造酱油中，乙酰丙酸的含量极微（<0.01%）。因而，测定乙酰丙酸的含量，可以判断是酿造酱油还是氨基酸液配制酱油。然而随着生活质量的日益提高，人们对于食品安全的关注度日益提高。GB2760- 2014《食品添加剂使用标准》中也提到了乙酰丙酸，但并未对添加的量有一个具体的指标。GB5009.252- 2016对乙酰丙酸的测定基质范围由之前的酱油扩展为食品，其中第一法提出了使用内标法测定食品中的乙酰丙酸。实际操作中，前处理方法沿袭GB5009.121- 2003（已废弃）脱氢乙酸的萃取模式，使用分液漏斗振摇萃取，并且比色管静置的方式对于易乳化的样品，需要较多的时间，无法应对大批量的样品检测。同时2次水洗的过程对乙酰丙酸的回收率影响较大。为了优化实验过程，缩短前处理时间，提高乙酰丙酸的回收率，对食品中乙酰丙酸的前处理过程加以改进。将样品称于50ml离心管中，更改分液漏斗萃取为离心管直接提取，更改无水硫酸钠脱水为滤头过滤。GB/ T27025- 2008中指出，实验室应对非标准方法、实验室设计（制定）的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的方法进行确认，以证实该方法适用于预期的用途。故在引用GB5009.252- 2016的基础上，本实验验证调整前处理过程后确保实现正常进行的可行性。

材料与仪器

1.GC- FID气相色谱：Agilent 7890A

2.乙酰丙酸准品：Sigma- Aldrich

3.正庚酸标准品：百灵威

4.样品：市售

5.浓HCL：默克

6.乙醚（分析纯）：凌峰

7.乙酸乙酯（色谱纯）：DikmaPure

标准储备液的配制

1.正庚酸内标标准储备溶液（5000mg/ L）：称取0.5g正庚酸（精确至0.00001），用乙酸乙酯定容至100ml容量瓶，混匀。

2.乙酰丙酸标准储备溶液（5000mg/L）：称取0.5g乙酰丙酸（精确至0.00001），用乙酸乙酯定容至100ml容量瓶，混匀。

仪器参数

1.参数

色谱柱：D B - W A X毛细管柱 （ 3 0 m×0.25mm×0.25μm）

柱温：120℃，保持1min，以8℃/min程序升温至230℃，保持4min

进样口和检测器温度：270℃

载气：高纯氮，纯度99.999%，流速：1.0mL/min

氢气流速：30mL/min

空气流速：300mL/min

尾吹气流速：30mL/min

进样方式：分流进样，分流比：25：1

进样体积：1ml

2.乙酰丙酸标准溶液色谱图

分项综述

1.专属性

专属性是指明确地测定出目标化合物的能力，考虑不纯，降解和基质影响等因素。测试项目及观察值，见表1。

3.准确度及精密度

选取4种不同基质样品中，分别进行低，中，高浓度水平的加标，每个浓度试验三次，评估回收率及相对标准偏差（RSD）。

（1）前处理过程：

称取5.00g事先均匀化的样品于50mL离心管，加入1.0mL正庚酸标准储备液，并对样品进行加标，样品中加标浓度水平分别是25mg/ kg，500mg/kg，1500mg/kg。加入10mL饱和NaCl溶液， 3.0mL浓盐酸。充分涡旋1min后，加入25ml乙醚，涡旋3- 5min，离心分离5min。吸取上层有机相于150mL平底烧瓶，再重复萃取两次，合并乙醚萃取液。45℃左右旋蒸至干，用乙酸乙酯定容至10ml，過滤上机。

（2）所得数据如下，计算样品中乙酰丙酸回收率。

（3）小结

从试验数据得知，回收率最低的是91.68%，相对标准偏差最低的是5.64%。实际实验过程中，酱油及奶粉易产生乳化现象，离心分离的过程减少了等待的时间，并且减少水洗和无水硫酸钠吸附过程后回收率保持较好的水平。同样的，不同基质的横向比较，能查看到饼干及奶粉这种含油样品，在旋蒸后含油量较高，峰型出现稍许拖尾，参考文献固相萃取-气相色谱联用测定酱油中乙酰丙酸，可以考虑之后对含油量较高样品进行除油的操作来降低油脂的影响。

4.检测限和定量限

方法检测限（MDL），MDL=3SD；定量限（LOQ），LOQ=10SD。

在不同基质样品中，进行10次曲线最低点加标再现性试验，评估3SD和10SD。

（1）加标溶液配制：

称取10份混合均匀的不同基质样品5克，并对其加标，加标浓度为25mg/kg，其余步骤同上。得到样品加标理论浓度为25mg/kg。

（2）小结：

乙酰丙酸方法检出限为：4.93mg/kg

乙酰丙酸定量限为：16.4 mg/kg

满足GB5009.252- 2016第一法的要求：检出限10mg/kg， 定量限25mg/kg。

用离心管代替分液漏斗萃取，改善静置为离心的方式完成GB5009.252-2016方法的测试，满足测试所需各项要求。在针对多批量样品时，前处理条件的改善，不仅减少了时间和人力成本，也提高了实验的回收率及效率，可以证明本实验室具备食品中乙酰丙酸测试的能力。