茅台酒曲植物乳杆菌大豆酸面团发酵面包的营养与抗氧化特性

杨紫璇，张宾乐，蒋慧，马子琳，武盟，徐岩,郑建仙，黄卫宁*，李宁，Filip Arnaut

1(江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122) 2(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122) 3(华南理工大学 轻工与食品学院，广东 广州，510640)4(焙乐道食品集团，比利时 布鲁塞尔，B1702)

酸面团作为一种传统发酵剂具有很多优势，能够提高面包的比容、质构和口感，赋予面包特殊的风味和抑制面包老化并延长货架期等[1]，同时在面包的营养特性方面也有着积极的影响[2]。

大豆粉营养成分(40%的蛋白质)丰富，将大豆粉添加到面包中势必会增加面包的营养。但是不经过处理，很多营养成分难以被消化、吸收和利用[3]。大豆中含有许多抗氧化活性成分如大豆异黄酮等。用大豆粉制作面包能很好的作为承载大豆异黄酮的食品[4]。乳酸菌发酵可以将生物利用率低的结合糖苷转换为生物利用率高的游离苷元形式的异黄酮，提高人体吸收率[5-7]。本实验室前期研究发现不同菌种的乳酸菌发酵剂可显著影响大豆粉酸面团中的ACE-I活性及其乳化特性，通过筛选合适的乳酸菌菌株发酵可提高大豆粉酸面团面包对人体健康的促进作用[8]。乳酸杆菌属是酸面团中最为常见的菌属[1]，而酒曲是目前分离筛选乳酸菌的重要来源之一。本研究采用大豆酸面团发酵技术制作大豆面包，测定了大豆酸面团及面包的营养与抗氧化特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MRS 杭州百思生物技术有限公司; 福林-酚(Folin-Ciocalteu)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、维生素E(Trolox)：美国Sigma公司；没食子酸，国药集团化学试剂有限公司；黄豆苷、黄豆苷元、染料木苷、金雀异黄酮，上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 面包粉，鹏泰(秦皇岛)面粉有限公司;干酵母，法国乐斯福(上海)有限公司; 大豆粉，青岛五谷康食品有限公司; 白砂糖、盐、油，市售; 茅台酒曲由江南大学生物工程学院酿造科学与酶技术中心提供。

1.2 仪器与设备

SP-752 型紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司;TH-B-402无菌操作台，无锡一净净化仪器设备厂; SPX-150C 型恒温恒湿培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备; TDL-5离心机，上海安亭科学仪器厂; SM-25搅拌机、SPC-40SP 醒发箱、SM-503烤箱，新麦机械(无锡)公司; Waters 600高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆酸面团及其面包面团制作

大豆面团：大豆粉34 g，蔗糖6 g，自来水160 g(DY=500)。面团搅拌均匀，不经发酵培养直接制作面包。大豆酸面团：大豆粉34 g，蔗糖6 g，自来水160 g(DY=500)。将产IA乳酸菌培养14 h，以达到产酶效率最高时期。取4支5 mL液体培养基菌液以保证面团中乳酸菌起始接菌量为107CFU/g[9]。在5 000 r/min下离心10 min，用无菌生理盐水洗涤沉淀2次。沉淀菌体用酸面团制作中的水溶解并加入面团中搅拌均匀，37 ℃下摇床培养(160 r/min)36 h。面包配方见表1。

表1 小麦面包、大豆面包和大豆酸面团面包配方Table 1 Formulations of wheat bread, soybean bread and soybean sourdough bread

注：由于大豆酸面团pH值很低，所以向其中加入NaHCO32.2 g调节。

1.3.2 大豆异黄酮单体含量测定

大豆酸面团发酵过程中，从0 h开始，每隔3 h取1次样，利用HPLC测定大豆酸面团发酵过程中游离苷元型黄酮(IA)：大豆苷元、染料木黄酮；结合糖苷型黄酮(isoflavone glycoside，IG)：大豆苷、染料木苷的变化情况。面包样品冷冻干燥后称量。取样品4 g与25 mL 100%甲醇混合均匀，并置于超声波破碎,85%功率下萃取40 min，放入4 ℃的冷冻离心机8 000 r/min离心20 min，将上清液转移到容量瓶中并用甲醇定容至25 mL，过0.22 μm微孔滤膜。色谱条件：C18柱(250 mm×4.5 mm, 5 μm)，流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=30∶8∶62,用色谱级磷酸调节pH至3.0，紫外260 nm下，流速1 mL/min，柱温25 ℃[10]。

1.3.3 总酚含量测定

首先，将1.3.2节中的酸面团提取液200 μL(上清液)中加入2 mL蒸馏水、250 μL福林酚试剂和750 μL的Na2CO3(7%)。室温下反应 8 min 后加入 950 μL 蒸馏水，然后室温下避光反应 2 h。反应结束后，在765 nm 波长下测吸光值。使用没食子酸制作标准曲线。每个样品设3个重复。总酚含量(mg GAE/g)以没食子酸当量计算[11]。

1.3.4 大豆肽分子质量分布

高效液相色谱法测定，以蒸馏水将酸面团配成质量浓度为5 mg/mL的样液，吸取2 mL样液，过 0.45 μm的有机微孔滤膜。用流动相定容至100 mL。色谱条件:Waters600高效液相色谱仪;色谱柱:TSKgel2000SWXL体积排阻色谱柱(300 mm×7.8 mm);流动相:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1；检测：UV220 nm；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃。数据处理及计算由Waters M32GPC软件自动进行[12]。

1.3.5 游离氨基酸含量

将制作好的面包样品进行冷冻干燥。准确称取干燥样品1.000 g于容量瓶中，用0.5 g/mL 的三氯乙酸(TCA)定容至25 mL，超声波破碎1 h，用双层滤纸过滤。取滤液12 000 r/min离心30 min，取上清用邻苯二甲醛进行柱前衍生化。色谱条件：ODS Hypersil色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以20 mmol/L醋酸钠的V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2溶液为流动相，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃[9]。

1.3.6 面包中抗氧化活性的测定

1.3.6.1 测定 DPPH 自由基清除能力

取1.3.2中的提取液100 μL与3.9 mL DPPH 溶液充分混合，避光30 min ，用分光光度计在517 nm下测定吸光度，根据Trolox计算样品DPPH自由基清除能力[13]。

1.3.6.2 测定ABTS自由基清除能力

取1.3.2中的提取液50 μL与5.0 mL ABTS溶液中充分混合，避光10 min ，用分光光度计在734 nm下测定吸光度，样品ABTS自由基清除能力计算同上步[13]。

1.4 数据分析

所有数据使用SPSS 19.0软件进行统计分析，使用ANONA方差分析显著性，显著性差异水平为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 酸面团发酵过程中4种大豆异黄酮单体变化

97%的大豆异黄酮都以结合的IG型式存在于大豆中，如大豆苷、染料木苷等。但IG不能发挥其功能活性，需经过β-葡萄糖苷酶处理后变成IA型式的异黄酮，如大豆苷元、染料木素。IA型式的黄酮是脂溶性的，能被小肠上皮直接吸收，为人体直接利用，有良好的生物活性[14]。用能高产IA的乳酸菌发酵制作大豆酸面团。大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素4种单体含量变化显著(图1)。相比发酵0 h的酸面团，发酵36 h总IA含量增加了8.87倍。发酵0～6 h大豆苷以及染料木苷含量急剧下降，原因可能是此时乳酸菌正处于对数生长期，菌体生长旺盛，产β-葡萄糖苷酶的效率高，促进IG形式转化成IA型式。6 h后，2种IA含量均呈现缓慢上升趋势，2种IG含量均呈现缓慢下降。可能是因为菌体在生长过程中产生大量有机酸使pH降低，过低的pH会导致β-葡萄糖苷酶酶活降低，进而影响IG结构向IA结构转换。大豆酸面团酚类物质起到了抗氧化作用，而大豆异黄酮是其中主要的抗氧化物质。IA的抗氧化能力高于IG[15]。瞿清燕等[9]接种了100株不同乳酸菌到豆乳中，测定最高的1株乳酸菌发酵后IA的总量是未发酵的8倍，经鉴定为植物乳杆菌。王欣欣等采用3种乳酸菌发酵黄浆水，其中戊糖片球菌水解IG的效率最高。发酵12 h后，IA从1.54 mg/L增加到16.89 mg/L，IG含量从73.76 mg/L减少至52.59 mg/L[16]。特定的乳酸菌在发酵过程中会产生β3葡萄糖苷酶，水解结合型IG中的氧苷键，脱去连接的1分子葡萄糖基团，使其转化为游离型IA。

图1 大豆酸面团发酵过程中大豆异黄酮含量变化Fig.1 Changes of soybean isoflavone content during sourdough fermentation

2.2 酸面团发酵过程中总酚含量变化

大豆酸面团中总酚含量在发酵初期呈现一定程度的下降，随后又呈现稳步上升趋势，这与徐春明[17]等研究结果类似，其研究表明总酚在纳豆发酵过程中先降低后升高。发酵初期降低的原因可能是酸面团中的水激活了大豆粉中的氧化酶系，使得酚被氧化，总酚含量降低。发酵后期(6 h后)乳酸菌分泌β-葡萄糖苷酶，将那些与糖和苷处于共轭结合状态的结合态酚类物质释放出来，变为游离态酚，从而使总酚含量升高[18]。大豆酸面团发酵前后大豆酸面团中总酚含量从3.83 mg GAE/g提高到5.29 mg GAE/g。

图2 大豆酸面团发酵过程中总酚含量变化Fig.2 Changes of soybean total phenolic content during soybean sourdough fermentation

2.3 酸面团发酵前后大豆肽分子质量变化

大豆肽的分子质量在10 kDa以下。本研究测定的大豆肽分子质量主要分布在10 kDa以下，发酵后低分子质量大豆肽的含量有显著提升(如图3所示)。

图3 未发酵(a)及发酵36 h(b)大豆酸面团蛋白肽分子质量分布图Fig.3 Molecular weight distribution profile of unfermented(a) and 36 h fermented(b) soybean sourdough

可能原因是乳酸菌发酵期间会分泌蛋白酶，将大分子肽段降解为低分子肽段[19]。植物乳杆菌比干酪乳酸菌的蛋白水解能力更佳[20]。植物乳杆菌对蛋白酶反应底物Succinyl-phe-pNA 具有较强的水解能力，说明其具有较强的蛋白酶活性。未发酵组大豆肽在分子质量2 kDa左右的含量极少，占总体的2.90%，发酵36 h后提高到23.74%，是未发酵的8.2倍。并且分子质量在10 kDa左右的多肽从70.66%下降到24.48%。沈蓓英[21]等将大豆多肽进行酶解，得到具有最强的抗氧化活性的大豆肽分子质量范围为700～1 000 Da。研究表明大豆蛋白经过水解后能产生抗氧化活性肽，这类肽能够对体系中自由基积累起到抑制作用，从而提高自由基的清除能力即抗氧化能力[22]。

表2 未发酵及发酵36 h大豆酸面团蛋白肽分子质量分布Table 2 Molecular weight distribution of unfermented and 36 h fermented soybean sourdough

2.4 面包中游离氨基酸含量

图5对比了3种面包中18种游离氨基酸组成。将大豆粉引入大豆面包(SB)中后，总游离氨基酸含量为63.38 mg/100 g面包，显著高于小麦面包(WB)45.11 mg/100 g。除Ser、Lys、Pro以外SB中其他氨基酸均高于WB。

图5 小麦面包、大豆面包和大豆酸面团面包中游离氨基酸含量Fig.5 Free amino acid content of wheat bread, soybean bread and soybean sourdough bread

大豆酸面团面包(SSB)中总游离氨基酸含量为128.06 mg/100 g是SB的2.02倍，引起这种变化的原因是酸面团发酵后，大豆酸面团游离氨基酸含量大幅度上升，用于面包制作后使面包的氨基酸含量大幅度上升，其中Phe、Val、Lys、Asp、Arg这几种含量上升幅度较其他氨基酸更高。有研究表明Lys和Arg可以与不饱和脂肪酸反应生成盐，从而抑制氧化[23]。

2.5 面包中大豆异黄酮含量

大豆面包中的结合型糖苷(IG)总量为8.93 mg/100 g面包，显著高于游离型苷元(IA)总量2.18 mg/100 g面包，与未发酵的大豆面团相类似，制作成面包后IA的比例有所上升，IG比例有所下降。发酵后的大豆酸面团面包中IG总量为5.72 mg/100 g面包，IA总量为6.39 mg/100 g面包。大豆酸面团面包中IA总量是大豆面包中IA总量2.93倍。说明酸面团制作可以使面包中IA显著提高。OTIENO等利用嗜酸乳杆菌发酵豆浆，豆浆中苷元型大豆异黄酮经24 h发酵后从8%增加至76.8%[24]。DAE等研究发现豆乳发酵后IA结构增加的数量无法达到IG结构减少的数量，且相差巨大。说明在发酵过程中IA与IG之间并不是完全的转化关系[25]。

表3 小麦面包、大豆面包和大豆酸面团面包的大豆异黄酮含量Table 3 Free soybean isoflavone content in wheat bread, soybean bread and soybean sourdough bread

2.6 面包抗氧化特性

特定的乳酸菌发酵可以产生β-葡萄糖苷酶，将结合型IG异黄酮转化成抗氧化活性更高的游离IA型异黄酮(黄豆苷元和染料木黄酮)，游离的苷元具有更广泛、更强烈的生物学活性[27]。并且大豆酸面团中总酚含量也有所上升。研究表明乳酸菌发酵能够释放一些不溶性酚类，并使其降解成为活性更高的抗氧化物，提高产品稳定性，因此采用乳酸菌发酵能够改善高温烘焙制品如面包等的抗氧化活性[28]。具有较高的抗氧化活性的疏水氨基酸残基都隐藏在蛋白质大分子的内部，很难与外界接触发挥作用。发酵后蛋白肽键被切断，可使其抗氧化活性基团充分暴露；经过乳酸菌发酵后，大豆蛋白肽键断裂，氨基酸释放，抗氧化作用得到进一步提升。这个结果也与LI等人的研究相似，发现发酵豆制品中分离的植物乳杆菌具有DPPH自由基、羟基自由基清除能力，以及过氧化氢抑制能力[29]。

图6 不同面包的DPPH和ABTS自由基清除能力Fig.6 The DPPH and ABTS radical-scavenging activity of different breads

3 结论

大豆酸面团发酵过程中游离型大豆异黄酮苷元含量显著提高。发酵使总酚含量从3.83 mg GAE/g提高到5.29 mg GAE/g。发酵36 h的酸面团中分子量2 kDa以下的抗氧化活性肽比未发酵组含量提高了8.2倍。相比于小麦面包与大豆面包，大豆酸面团面包在游离氨基酸、游离型大豆异黄酮含量上显著提升，DPPH抗氧化能力分别是前两者的12.6倍和3.0倍；ABTS抗氧化能力分别是前两者的4.4倍和1.3倍。大豆酸面团发酵技术有助于改善其面团及面包的营养及抗氧化能力。