乙醇熏蒸对双孢蘑菇保鲜品质的影响

张洪翠，李云云，靳苗苗，张敏

(西南大学 食品科学学院，农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆)， 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆,400715)

双孢蘑菇(Agaricusbisporus)是全球性栽培最多的食用菌[1]，味美且营养价值高，深受消费者喜爱。然而双孢蘑菇采后易受机械损伤、失水、褐变、微生物侵染，失去商品价值[2]，常温下货架期只有1～3天[3]，如何延长双孢蘑菇采后贮藏期并保持其品质是亟待解决的问题。双孢蘑菇是由分化的菌丝组成，菌丝为轻质晶格结构[4]，交织疏松且缺少可以防止微生物侵袭和水分散失的物理结构[5]；采收后其同化作用已停止，而生命活动仍在进行，异化作用(呼吸作用)直接或间接地影响着各种生理生化过程，降低其耐贮性和抗病性[6]。研究表明，乙醇对细胞具有强渗透力，可导致微生物体细胞蛋白质永久变性，从而杀死微生物，减少果蔬营养成分消耗，延长果蔬贮藏期[7]；另外，乙醇通过抑制乙烯的生物合成，能够有效抑制呼吸强度的升高[8]。HERPPICH等[9]用乙醇处理白芦笋，结果表明乙醇处理能够抑制呼吸强度、微生物和失重率的增长，维持较高的可溶性固形物和Vc含量，保持较好的白芦笋销售品质。另外，已有研究表明，乙醇处理具有保持果实白度和营养成分，延缓组织衰老，控制采后腐烂等作用，对杨梅[10]、草莓[11]、青花菜[12]、桃[13]、苹果[14]等多种果蔬具有良好的保鲜效果。目前，关于乙醇熏蒸处理对双孢蘑菇采后品质影响的研究还未见报道。因此，本文通过对双孢蘑菇进行乙醇熏蒸处理，研究不同浓度乙醇对双孢蘑菇保鲜品质的影响，为乙醇熏蒸处理在双孢蘑菇保鲜中的应用提供科学依据，解决双孢蘑菇采后的保鲜问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜双孢蘑菇，购于北碚天生农贸市场。要求同批采收，无病虫害和机械损伤，菇体成熟度、大小、形状、颜色均匀一致，采后8 h内运送至实验室。

95%乙醇、牛血清蛋白、冰乙酸、无水乙酸钠、茚三酮、正丙醇、正丁醇、乙二醇、L-亮氨酸、异丙醇、抗坏血酸、甲醇，成都市科龙化工试剂厂；NaOH、HCl、考马斯亮蓝G-250、H3PO4，重庆川东化工集团有限公司；KI、KIO3、淀粉、无水乙醇，重庆北碚化学试剂厂；平板计数琼脂(PCA)，北京奥博星生物技术公司。

1.2 仪器与设备

Pac Check®Model 650EC顶空分析仪，美国MOCON公司；HWS低温恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司；H1650R台式高速冷冻离心机，湖南湘仪公司；UltraScan®PRO测色仪，美国HunterLab公司；UV-2450PC紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.3 样品处理

挑选大小一致，无开伞，无病害，无机械损伤的双孢蘑菇进行处理。将双孢蘑菇随机分为4组，每组双孢蘑菇800 g左右，放入泡沫箱内，同时放入展开的4层纱布(远离双孢蘑菇)，分别取一定量的乙醇(体积分数95%)均匀滴在纱布上，立即密封，室温(25 ℃)熏蒸处理3 h。试验中乙醇熏蒸浓度分别为0(CK)、200、400、600 μL/L(乙醇溶液体积与泡沫箱体积比)，处理结束后，将双孢蘑菇通风30 min后放入(3±1)℃的冷藏柜预冷30 min，最后分装到PE塑料袋(厚度为40 μm)内封口，每袋(100 ±5)g，每组有3个平行。将包装后的双孢蘑菇放于(3±1)℃的冷藏柜中贮藏12 d，每2 d测定1次指标。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 呼吸强度

呼吸强度采用静置法经顶空分析仪进行测定[15]。用顶空气体分析仪检测大气中的CO2含量，记为ψ0，随机选取双孢蘑菇80 g，放入干燥皿中密封，25 ℃下静置30 min，检测干燥皿中CO2含量，记为ψ1。呼吸强度以每小时每千克双孢蘑菇在呼吸代谢过程中释放的CO2的质量表示。计算公式如下：

(1)

式中：ψ0，大气中CO2体积分数，%；ψ1，干燥皿中CO2体积分数，%；V，干燥皿中密闭空间的体积，mL；m，双孢蘑菇质量，kg；t，测定时间，h；1.96，CO2的摩尔质量/摩尔体积之比(=44/22.4；按标准状况下计算)。

1.4.2 失重率

采用称重法测定，按公式(2)计算：

(2)

1.4.3 白度值

参考JAWORSKA等[16]方法进行测定。

1.4.4 硬度值

参考JIANG等[17]方法进行测定。用美国CT-3型质构仪测定，探头直径为5 mm，将双孢蘑菇去柄，切掉菌盖上2 mm厚的表皮，将切好的双孢蘑菇固定在操作台上，保持切面与探头接触面平行，探头以2 mm/s的穿刺速率进行下压，下压深度为6 mm，得到力与时间的作用曲线，最大峰值(Nmax)即为硬度值。

1.4.5 可溶性固形物

参考曹健康等[18]方法进行测定。采用UV-2450便携式手持折光仪测定。

1.4.6 Vc含量

采用碘酸钾滴定法[18]进行测定。

1.4.7 游离氨基酸

采用茚三酮显色法[18]进行测定。

1.4.8 微生物

参照GB/T 4789.2—2010《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》[19]进行测定。

1.4.9 感官评价

参考石启龙等[20- 21]方法。由经过培训的6人对双孢蘑菇的色泽、质地、异味等感官指标进行评定。感官指标评定标准如表1所示。

表1 双孢蘑菇感官指标评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of Agaricus bisporus

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2010 进行数据整理，用SPSS 13.0进行统计分析，使用最低显著性差异法(LSD)进行显著性差异检验，显著性水平为 0.05，Origin 2016进行图像处理。

2 结果与分析

2.1 乙醇熏蒸对双孢蘑菇呼吸强度的影响

呼吸强度是衡量果蔬组织新陈代谢的一个重要指标，双孢蘑菇属于呼吸跃变型园艺产品，采后子实体呼吸作用旺盛，会消耗蘑菇体内关键营养成分，降低其食用品质和贮藏性，所产生的呼吸热也会影响其贮运[22]。如图1所示，贮藏期间各组双孢蘑菇的呼吸强度呈先上升后下降的趋势。各组双孢蘑菇在贮藏第2天都达到呼吸高峰，与对照组相比，处理组都极显著地降低了呼吸峰值(p<0.01)，其中400 μL/L组为70.66 mg/(kg·h)，将呼吸峰值降低了20.53%；600 μL/L组贮藏前、中期与对照组差异显著(p<0.05)，从第10天起无显著差异(p>0.05)，可能是因为乙醇浓度过高，导致乙醇过量渗入细胞，使胞内蛋白变性，对细胞产生毒害，使双孢蘑菇后期抵抗力变弱，微生物大量繁殖导致腐败，致使呼吸强度升高。由此可见，适当浓度乙醇熏蒸处理能显著抑制贮藏期间双孢蘑菇的呼吸强度，尤其是400 μL/L处理组，与对照组在整个贮藏期间都存在极显著差异(p<0.01)。这与WEBER等[23]用0.3 mL/kg的乙醇熏蒸处理苹果所得结果一致。ASODA等[24]用乙醇熏蒸处理西兰花也得出相似的结论。

图1 乙醇熏蒸对双孢蘑菇呼吸强度的影响Fig.1 Effects of ethanol fumigation on respiration rate of Agaricus bisporus

2.2 乙醇熏蒸对双孢蘑菇失重率的影响

水分含量是衡量双孢蘑菇新鲜程度的重要指标之一[25]。双孢蘑菇贮藏期间的失重主要是由于失水造成的，一方面细胞组织丧失的水分，导致包装袋内积水，易孳生致病微生物；另一方面采后蒸腾作用是不可逆的，散失的水分无法得到补偿，菇体会萎蔫、褐变，严重影响双孢蘑菇的感官品质[26]。如图2所示，各组双孢蘑菇的失重率均随贮藏时间的推移持续升高，但贮藏前期上升急促，这可能与双孢蘑菇表皮结构薄弱，无法阻止表面快速脱水有关；还可能与前期双孢蘑菇呼吸强度(图1)和蒸腾作用较高有关。贮藏0～4 d，200 μL/L处理组与对照组一直存在显著性差异(p<0.05)；贮藏至第6 d，400 μL/L处理组与对照组开始有极显著差异(p<0.01)。贮藏12 d，各组失重率分别达到6.66%、4.57%、3.51%、5.32%，组与组之间差异显著(p<0.05)，其中400 μL/L处理组比对照组失重率降低了47.3%。由此可知，适当浓度的乙醇熏蒸处理双孢蘑菇能够显著抑制失重率的上升。这可能是由于乙醇作为脂肪醇溶解在膜脂双层中，使细胞膜稳定性和疏水性增强[27]；也可能是由于乙醇使细胞保持较高的渗透压[28]，阻碍水分向细胞壁和细胞间隙渗透，从而降低失重[29]。

图2 乙醇熏蒸对双孢蘑菇失重率的影响Fig.2 Effects of ethanol fumigation on weight loss of Agaricus bisporus

2.3 乙醇熏蒸对双孢蘑菇白度的影响

白度值是判断蘑菇贮藏期间色泽变化的重要指标，也直接影响其商品性。如图3所示，随着贮藏时间的延长各组双孢蘑菇的白度值不断降低，且后期下降急促。在整个贮藏期间，200 μL/L组、400 μL/L组与对照组均存在显著性差异(p<0.05)；第10天后，600 μL/L组与对照组也产生显著差异(p<0.05)。到贮藏期结束时，处理组使白度值分别维持在80.48、81.55、78.48，而对照组只有76.85，处理组与对照组差异显著(p<0.05)。刘洪丽[30]用乙醇处理鲜切莴苣和荸荠，降低了褐变多酚底物的浓度，从而减少色素类物质的生成，有效减缓了鲜切莴苣和荸荠的褐变进程。HU等[27]研究表明，乙醇处理能抑制褐变，是由于外源乙醇处理能够抑制活性氧和氧化类酶的活性。

图3 乙醇熏蒸对双孢蘑菇白度的影响Fig.3 Effects of ethanol fumigation on whiteness of Agaricus bisporus

2.4 乙醇熏蒸对双孢蘑菇硬度的影响

果蔬的硬度能够直接反应果蔬的贮藏效果，在贮藏期间果胶、多糖等大分子物质降解导致硬度下降。如图4所示，在贮藏期间各组双孢蘑菇的硬度呈波动性下降趋势。贮藏前期，硬度下降速率快，可能是由于前期失重和呼吸强度高造成的。第4天，各组硬度分别由开始的49.97 N下降至40.42、38.38、43.92、42.5 N，其中400 μL/L组与对照组存在显著差异(p<0.05)。贮藏末期，相比处理组，对照组硬度下降速率快，可能与后期对照组微生物增加，加速了双孢蘑菇的腐败变软有关。第12天，处理组硬度分别达到36.18、38.78、36.89 N，对照组达到32.07 N，处理组硬度明显高于对照组，200 μL/L组与对照组存在显著差异(p<0.05)，其中400、600 μL/L组与对照组存在极显著差异(p<0.01)。表明乙醇熏蒸能有效维持双孢蘑菇的硬度，以400 μL/L组效果最为显著。乙醇能够抑制果实的软化，可能与其抑制细胞壁降解有关[28]。

图4 乙醇熏蒸对双孢蘑菇硬度的影响Fig.4 Effects of ethanol fumigation on firmness of Agaricus bisporus

2.5 乙醇熏蒸对双孢蘑菇总酚含量的影响

酚类物质的存在是果蔬酶促褐变发生的必要条件，与果蔬的品质、风味形成等密切相关。采后的菇体中含有大量的酚类物质，与氧气接触后被氧化为赤褐色的醌和水，最终氧化聚合成黑褐色物质[31]。如图5所示，在整个贮藏期间双孢蘑菇总酚含量呈先升高后下降趋势。贮藏第2天，总酚含量达到峰值，可能是因为贮藏前的切根处理的外界胁迫，加快了苯基丙酸类合成途径，产生了更多的酚类物质来抵抗外界的伤害[32]，其中400 μL/L、600 μL/L组总酚含量显著低于对照组(p<0.05)；到贮藏末期，与对照组相比，处理组显著抑制了总酚的产生(p<0.05)。总体而言，乙醇熏蒸能一定程度上降低总酚含量，特别是400 μL/L组整体效果最好，可能与乙醇熏蒸处理抑制总酚的合成，从而降低贮藏过程中的总酚含量有关。YAN等[33]研究表明外源乙醇能抑制苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达，从而抑制PAL酶的合成，进而抑制酶促褐变底物酚类物质的合成，抑制酶促褐变。

图5 乙醇熏蒸对双孢蘑菇总酚含量的影响Fig.5 Effects of ethanol fumigation on total phenol content of Agaricus bisporus

2.6 乙醇熏蒸对双孢蘑菇Vc含量的影响

Vc是人类营养中最重要的维生素之一，是果蔬重要的营养指标。如图6所示，在整个贮藏期间双孢蘑菇抗坏血酸含量整体呈下降趋势。贮藏第2天，处理组与对照组之间差异显著(p<0.05)，其中200、400 μL/L组与对照组在整个贮藏期间均存在极显著差异(p<0.01)；到贮藏结束时，200、400 μL/L组抗坏血酸含量分别维持在1.64 mg/100g、1.91 mg/100g，而对照组已降至1.24 mg/100g。由此表明，乙醇熏蒸能有效缓解双孢蘑菇Vc含量的下降。这可能是由于乙醇蒸气对双孢蘑菇代谢活性的抑制作用，使最初形成的抗坏血酸在贮藏期间没有得到利用[34]。马瑜等[35]用乙醇熏蒸处理草莓，结果表明，适量浓度的乙醇能维持较高的抗坏血酸含量。乙醇处理葡萄[36]、蓝莓[37]等的研究也得出相似结论。

图6 乙醇熏蒸对双孢蘑菇Vc含量的影响Fig.6 Effects of ethanol fumigation on Vc content of Agaricus bisporus

2.7 乙醇熏蒸对双孢蘑菇可溶性蛋白质含量的影响

可溶性蛋白质参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，是果蔬品质和营养的重要指标之一。如图7所示，随着贮藏时间的延长，各组双孢蘑菇可溶性蛋白质含量整体呈波动性下降趋势。1～4 d可溶性蛋白质含量下降急促，可能是由于双孢蘑菇采收后营养供应被切断，且刚采摘后生理代谢旺盛，消耗了大量的可溶性蛋白质。第4天，处理组可溶性蛋白质含量分别降至2.46、2.67、2.53 mg/g，对照组降至2.04 mg/g，处理组与对照组差异显著(p<0.05)，3个处理组之间不存在显著差异(p>0.05)。第6天，CK组可溶性蛋白质含量有上升的趋势，可能与CK组失水率增加，降低可溶性蛋白质水解有关。第12天，400 μL/L组可溶性蛋白质含量为2.44 mg/g，而对照组已降至1.95 mg/g，两组差异极显著(p<0.01)，200 μL/L与600 μL/L组分别为2.2 mg/g和2.17 mg/g，与对照组差异显著(p<0.05)。由此可见，乙醇熏蒸处理双孢蘑菇能显著抑制可溶性蛋白质含量的下降，其中400 μL/L组效果最明显。陶炜煜[38]用不同浓度的乙醇熏蒸处理鲜切西兰花，结果表明6 kg/mL的乙醇熏蒸处理在抑制可溶性蛋白质降低方面效果最好。

图7 乙醇熏蒸对双孢蘑菇可溶性蛋白质含量的影响Fig.7 Effects of ethanol fumigation on soluble protein content of Agaricus bisporus

2.8 乙醇熏蒸对双孢蘑菇微生物的影响

子实体是由菌丝扭结形成的结构，菌丝纤细，无角质层的保护，极易遭致微生物的侵染[39]。乙醇熏蒸对双孢蘑菇菌落总数的影响如图8所示，第0天，乙醇熏蒸结束后立刻测各组微生物含量，分别由对照组的6.7 lg(CFU/g)降至200 μL/L组的5.87 lg(CFU/g)，400 μL/L组的5.69 lg(CFU/g)，600 μL/L组的5.47 lg(CFU/g)，说明与对照组相比乙醇处理能够明显杀灭部分微生物(p<0.01)，且在一定范围内，浓度越大效果越好，处理组之间存在显著差异(p<0.05)。第2天，对照组微生物含量相对初始值降低，可能是因为双孢蘑菇于PE包装袋内贮藏，氧气含量减少，抑制了部分好氧菌的繁殖。随着贮藏时间的延长，各组微生物都在增加，600 μL/L组后期微生物繁殖较快，可能是由于乙醇浓度过高，短时间内使微生物体表蛋白质变性，表面蛋白凝固形成保护层，致使后期存活的微生物大量繁殖[33, 40-41]。HERPPICH等[9]也认为，适量浓度的乙醇处理能抑制贮藏期间白芦笋微生物的生长，但并不是乙醇浓度越高越好。第12天，对照组微生物含量高达8.32 lg(CFU/g)，处理组分别为7.49 lg(CFU/g)、7.24 lg(CFU/g)、7.75 lg(CFU/g)，3个处理组与对照组均存在极显著差异(p<0.01)。整体而言，乙醇熏蒸处理能够极显著杀灭、抑制微生物的生长(p<0.01)，3个处理组中，400 μL/L组效果最佳。乙醇能够有效抑制菌落总数的增长，可能与乙醇使菌体蛋白脱水变性，且降低菌体表面张力，改变细胞膜渗透性及原生质结构的作用有关[42]。冯晓汀等[43]用乙醇熏蒸处理鲜切西兰花也得出类似结论。已有研究表明，乙醇处理可显著控制灰霉、轮帚霉、桔青霉、绿色木霉等病菌孢子的萌发[44]。

图8 乙醇熏蒸对双孢蘑菇菌落总数的影响Fig.8 Effects of ethanol fumigation on total bacterial counts of Agaricus bisporus

2.9 乙醇熏蒸对双孢蘑菇感官评价的影响

乙醇熏蒸对双孢蘑菇感官评价的影响如图9所示，双孢蘑菇感官评分随着贮藏时间的延长而降低，但后期下降速度相对较快，并且异味、发黏、褐变严重，可能与后期微生物(图8)繁殖较快有关。第6天，对照组开始出现稍软、发黏、异味现象，而乙醇处理组均保持较好的品质。第8天，对照组褐变严重并伴有开伞现象，而此时乙醇处理组仍没有发黏、异味现象，可能与乙醇处理能有效抑制微生物(图8)繁殖有关。第10天开始，对照组已出现严重异味、发黏、褐变现象，此时感官评价得分为5.15分，已失去商品价值，而乙醇处理组仍保持在6分以上，具有一定的商品价值。第12天，400 μL/L组的感官评价得分为6.55分，仍具有一定的商品性，但其他3组都已失去商品价值。可见，乙醇熏蒸处理可以有效地保持双孢蘑菇的感官评分。

图9 乙醇熏蒸对双孢蘑菇感官评价的影响Fig.9 Effects of ethanol fumigation on sensory properties of Agaricus bisporus

3 结论与讨论

本试验研究了不同质量浓度(200、400、600 μL/L)的乙醇熏蒸对双孢蘑菇保鲜品质的影响。试验结果表明，采用适当浓度的乙醇熏蒸处理双孢蘑菇能够显著抑制菌落总数的上升，同时有效降低了双孢蘑菇的总酚含量，从而抑制了酶促褐变。在整个贮藏期间，乙醇熏蒸处理能显著抑制呼吸强度和失重率的上升，有效延缓可溶性蛋白质含量的损耗，减少Vc含量的下降，且能保持较高的白度、硬度和感官评价。整体而言，400 μL/L处理组综合保鲜效果最好，能够有效延长双孢蘑菇的贮藏期，且未对其感官品质产生不良影响。

由于双孢蘑菇长期生活在阴暗潮湿的环境中，其演变而成的防御机制薄弱，采后呼吸作用成为新陈代谢的主导因素，耐贮性和抗病性降低，鲜度下降快。采后生理变化和微生物的生长繁殖是导致双孢蘑菇子实体腐败变质的主要原因。乙醇作为脂肪醇能溶解在膜脂双层中，增强细胞膜的稳定性和疏水性，有效减缓果蔬的水分散失；另外，乙醇对细胞的渗透力强，可使菌体蛋白永久变性，从而抑制微生物的生长[41]。本研究表明，乙醇熏蒸处理能够显著抑制微生物的繁殖，400 μL/L处理组在整个贮藏期间效果最佳。这与乙醇处理能抑制鲜切山药[45]、鲜切西兰花[43]、鲜切芒果[46]、杨梅[47]等菌落总数的增长的研究结果相似。乙醇处理还能有效减缓细胞壁的降解进而维持果蔬硬度[37,46,48-49]，降低果蔬营养物质的消耗，保持果蔬特有的香气。杨爱萍等[47]用 100、250、500和1 000 μL/L乙醇熏蒸处理杨梅果实3h，结果表明500 μL/L乙醇处理可以有效保持果实的营养品质，乙醇用量过高，则会引起果实的渗透伤害。徐莉等[48]在鲜切菊芋上采用150、300、450 μL/L乙醇熏蒸5 h，发现450 μL/L处理组抑制褐变效果最好。CHERVIN等[50]报道当乙醇处理浓度小于5 mL/kg时，可有效控制葡萄的采后腐烂，而较高的剂量可能诱导果实褐变[51]，并增加果实组织中的渗透胁迫。综上可知，乙醇蒸气的有效性受乙醇浓度的影响。由于处理对象不同，乙醇处理的最佳浓度也有所差异。本研究发现，双孢蘑菇的保鲜效果与乙醇处理浓度密切相关，在一定浓度范围内，乙醇浓度越高，对双孢蘑菇的保鲜作用越大。若乙醇浓度过高，可加快微生物体蛋白质变性的速度，表面蛋白凝固形成保护层，阻断了乙醇进入菌群、菌体内部，导致贮藏后期抑菌能力减弱；另一方面，高浓度乙醇可能对细胞产生毒害，降低双孢蘑菇抵抗力[52]。这可能是本研究中600 μL/L处理组的保鲜效果不及400 μL/L处理组的原因。

乙醇熏蒸处理是延长双孢蘑菇采后保鲜期安全简便且经济有效的方法，对双孢蘑菇保鲜具有一定的应用价值。然而，乙醇如何影响双孢蘑菇的采后生理，在理论上还缺乏深入的认识，其作用机理有待进一步探究。