六种特级初榨橄榄油挥发性香气成分的比较

刘少敏，何天鹏，薛丹丹，邓海莲，杨平，宋焕禄，王蓓，刘野

(北京工商大学 食品学院，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京，10048)

橄榄油是从新鲜油橄榄中冷榨提取而得到的一种高档食用植物油，富含不饱和脂肪酸(油酸占55% ～ 83% )、多酚、角鲨烯以及维生素等多种营养物质，具有抗氧化、预防癌症、预防心脑血管疾病、调节胆固醇和调节人体生理机能等诸多作用[1]。因其丰富的营养成分和优质的口感，橄榄油深受人们青睐，在西方国家被誉为“液体黄金”、“地中海甘露”、“植物油皇后”等，享有极高的评价[2]。橄榄油的风味在消费者偏爱程度以及橄榄油质量评价上举足轻重，国际橄榄油理事会根据酸价、过氧化值、特定波长紫外吸收值( K232、K270) 及游离脂肪酸含量等参数并结合感官评分来鉴定橄榄油的等级。目前，国内外测定橄榄油风味的前处理方法主要有固相微萃取(solid phase micro-extraction, SPME)、同时蒸馏提取(simultaneous distillation extraction, SDE)、动态顶空样品制备(dynamic headspace sampling, DHS)和吹扫捕集(Purge & Trap, P&T)，再结合气相色谱-嗅闻-质谱联用(gas chromatography-olfactrometry-mass spectrometry, GC-O-MS)进行香气成分的分析[3-10]。

在挥发性成分检测方面，GC-MS可以发挥极大作用，在橄榄油中被检测出的挥发性化合物的数量已经超过180多种[11]，但研究表明在大量的挥发性化合物中其实只有很小的一部分对食品风味有贡献[12]。另一方面，有些香气物质浓度较低，不能通过 GC-MS 检测到，但同时因为其阈值也较低，实则其对样品的香气贡献程度很大，所以单纯依靠 GC-MS 检测存在很大局限性。GC-O 是将气相色谱的分离能力与人类鼻子敏感的嗅觉相结合鉴定食品香气物质的一种方式，可以弥补GC-MS的不足之处。同时可以采用电子鼻结合PCA对几种橄榄油进行相似度对比分析，结果更准确。

本文采用SPME-GC-O-MS结合电子鼻对在中国销售较好的6种进口特级初榨橄榄油进行分析鉴定，以期对中国进口橄榄油风味检测提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

西班牙：品利特级初榨橄榄油、贝蒂斯特级初榨橄榄油

意大利：欧丽薇兰特级初榨橄榄油、欧萨特级初榨橄榄油

希腊：爱琴尼雅特级初榨橄榄油、希波克特级初榨橄榄油

1.2 试剂

NaOH(分析纯)，西陇科学股份有限公司；乙醚、异丙醇、百里香酚酞、95%乙醇、异辛烷(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；系列正构烷烃(C7～ C30)(色谱纯)，北京化学试剂公司；4-甲基-2-戊醇(色谱纯)，美国Sigma公司；正己烷(色谱纯)，美国Fisher公司。

1.3 仪器与设备

iNose型电子鼻,上海瑞玢国际贸易有限公司；BSA224S-CW型电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；UV-2800A型紫外可见分光光度计,龙尼柯(上海)仪器有限公司；40 mL顶空瓶,德国Gerstel公司；固相微萃取手动进样器50/30 μm DVB/CAR/PDMS,美国Supelco公司；HH-1 数显电子恒温水浴锅,常州国华电器有限公司；7890A-7000B气相色谱-质谱联用仪，配有EI离子源及NIST 08数据库,美国Agilent公司；6890N-5975C气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司；Sniffer9000 型嗅闻仪,瑞士Brechbuhler公司；30 m×0.25 mm×0.25 μm DB-Wax和DB-5色谱柱,美国J&W公司。

1.4 实验方法

1.4.1 感官评价

橄榄油感官评价有8个经专业训练的嗅闻人员完成，品评需在明亮、安静且无味的环境下进行。品评前1 h品评人员不得进食气味较大的食物，不得沾染异味，以免影响品评结果。品评期间需独立完成。每个样品间需间隔2 min再继续进行评定。量取样品各10 mL置于40 mL顶空瓶中，观察其澄清度，嗅闻并评分。评分标准采用10分制，能强烈感受到指定风味记为10分，无法感受到记为0分；极澄清记为10分，极浑浊记为0分。

1.4.2 品质指标测定

酸价和紫外吸光值分别依照GB5009.229—2016和GB/T22500—2008/ISO 3656:2002进行测定[13-14]。

1.4.3 固相微萃取(SPME)操作方法

用5 mL移液枪移取10 mL橄榄油样品于40 mL顶空瓶中，再用10 μL微量注射器吸取1 μL浓度为401 μg/μL的内标物4-甲基-2-戊醇[15-16]于顶空瓶中，盖盖密封。将顶空瓶置于60 ℃水浴锅中平衡20 min，然后将SPME萃取头插入顶空瓶中，推出纤维涂层使其开始吸附香气成分，吸附时间为40 min，最后将纤维涂层收回，拔出萃取头准备进样。

1.4.4 GC-O-MS分析条件

气相色谱条件：色谱柱：DB-Wax石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、DB-5石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃，解析5 min；升温程序：初始温度为40 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min升温至200 ℃；最后以10 ℃/min升温至230 ℃，保持3 min；以高纯氦气(He)为载体，恒定流速1.2 mL/min；进样方式为不分流。

质谱条件：电子轰击(electron impact，EI)离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z40～500。进样口温度250 ℃，传输线的温度为280 ℃。

嗅闻条件：为了防止实验员鼻黏膜干燥，需将加湿空气以30 mL / min的速度供应到嗅闻口。

1.4.5 化合物定性方法

化合物的鉴定由3种方法结合使用：NIST库检索；计算化合物的保留指数(RI)，并与flavornet中标准RI值进行对比；通过嗅闻口嗅闻到的气味特征，与检索出化合物的标准风味进行对比定性。

其中保留指数(RI)的计算方式是根据C7～ C30的系列正构烷烃换算得到，公式如下：

(1)

式中：n表示正构烷烃的碳原子个数，tn表示正构烷烃Cn的保留时间，tn+1表示正构烷烃Cn+1的保留时间，ta表示样品中某未知化合物的保留时间(需满足ta处于tn与tn+1之间)。

1.4.6 化合物定量方法

以浓度为401 μg/μL的4-甲基-2-戊醇为内标物(样品中本身不存在内标物质，且内标与其他物质出峰互不影响)，通过峰面积与浓度的关系计算得到未知化合物的浓度，公式如下：

(2)

式中：CIS为内标物的浓度，AIS为内标物的峰面积，Cx为未知化合物的浓度，Ax为未知化合物的峰面积。

1.4.7 电子鼻检测

每种油样量取10 mL，备用。先用空气清洗传感器，清洗时间为200 s，然后通过真空泵将样品中的气体吸入到电子鼻中，进气速度为1 L/min，检测时间为240 s。每种油样品做3个平行，每个平行样品测定1次。

2 结果与分析

2.1 6种橄榄油感官评价结果分析

如图1所示，特级初榨橄榄油风味轮廓中，果香、青草香、甜香和油脂香为主要贡献风味，而蘑菇、醋酸和金属的香气成分贡献就相对较小。除甜香和醋酸差异较大外，其他几种风味趋势均相似，只是强度上略有不同，其整体风味也会有差异。经分析比较感官鉴评结果可得西班牙的品利、贝蒂斯在果香、青草香和金属香方面特别契合，其他风味上略有差别，但总体趋势一致，都极澄清，喜好排名分别为5和6；意大利的欧丽薇兰和欧萨在果香、金属和蘑菇香强度上最为一致，油脂香和青草香略有差别，整体风味较统一，澄清度均不高，喜好排名分别为2和4；希腊的爱琴尼雅、希波克果香、青草香和金属香强度最为相似，甜香和蘑菇香略有差别，整体风味较相似，均较澄清，喜好排名分别为3和1。通过感官鉴评，可以从感官的角度区分各类橄榄油并了解人们对各种橄榄油的喜好程度。

图1 6种橄榄油间气味轮廓比较分析图Fig.1 Comparative analysis of odor profile in six kinds of olive oil

2.2 6种橄榄油酸价和紫外吸光度比较

本实验所用特级初榨橄榄油样品的酸价和紫外吸光度如表1所示。从各项指标数值可得所有样品均符合特级初榨橄榄油的等级要求(酸度≤0.8%，即1.6 mg/g，K232≤2.50，K270≤0.22)[17]。

2.3 气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O-MS)联用对不同橄榄油香气成分分析

表1 橄榄油的主要品质指标Table 1 The major quality indicators of olive oil

本次试验选取了3个国家6种特级初榨橄榄油为研究对象，经SPME-GC-O-MS通过DB-Wax和DB-5两根色谱柱进行分析，得到总离子流图，如图2和图3所示。

图2 特级初榨橄榄油(欧萨)DB-Wax总离子流图Fig.2 Total ionic chromatogram of extra virgin olive oil (ousa, DB-Wax)

图3 特级初榨橄榄油(欧萨)DB-5总离子流图Fig.3 Total ionic chromatogram of extra virgin olive oil (ousa, DB-5)

经分析检测得到了65种挥发性香气活性化合物，如表2所示。表2结果显示，检测到的挥发性香气活性化合物中，醛类物质最多，达到16种，其次还有醇类12种，酯类9种，酮类6种，烯烃及萜烯类8种，芳香类5种，酸类3种和6种其他类型化合物协同生成橄榄油风味。其中，醇类物质可以贡献橄榄果香或其他清新的香气成分，且其含量较高，如顺-3-己烯-1-醇(青草味)，但因其阈值也较大[9,18]，所以贡献相对较弱；醛类物质可以呈现青草味、果味、苦味和涩味等丰富且积极的风味，如己醛(青草味)、反式-2-己烯醛(苦杏仁)、反式-2-壬烯醛(黄瓜，脂肪)等，因其阈值较低，所以对橄榄油风味贡献极大；酯类提供果味，如乙酸顺式-3-己烯酯(青香蕉)；酮类提供辛辣味，如6-甲基-5-庚烯-2-酮(胡椒，蘑菇)，阈值低，贡献也较大；芳香类和帖烯类相对阈值较大，贡献较低[18]。结合化合物含量与嗅闻结果可得，特级初榨橄榄油中特征香气成分有反-2-己烯醛(苦杏仁)、己醛(青草味)、反-2-壬烯醛(黄瓜，脂肪)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(胡椒，蘑菇)和顺-3-己烯-1-醇(青草味)等小分子化合物。如图4所示，各品牌橄榄油香气成分种类差别不大，但在整体化合物含量上存在差异。贡献最大的醛类以爱琴尼雅含量最高，贝蒂斯最低，差距极大；醇类以欧萨含量最高，但其他几类橄榄油中相对含量也不低，差距不大；酮类物质希波克含量极高，其他几种油样中含量均较低，差距不大；酸类物质希波克中含量极高，其次为品利和爱琴尼雅，贝蒂斯、欧丽薇兰和欧萨中几乎不存在；酯类物质以爱琴尼雅含量居首位，其他呈梯度递减；芳香类物质以希波克含量极高，其他呈递减状态。由于其各类风味物质的含量不同综合作用，因此各品牌橄榄油风味也有不同程度的区别。

表2 6种特级初榨橄榄油主要挥发性香气成分Table 2 The major volatile aroma components in six kinds of extra virgin olive oil

注：表中“-”表示不存在，“RI”表示通过对比保留指数确定的物质，“MS”表示通过质谱确定的物质，“O”表示可以嗅闻鉴定到其香气特征。

2.4 电子鼻对不同种类橄榄油香气成分分析

电子鼻检测到的橄榄油样品气味信号经过PCA分析如图5所示，其中主成分1和主成分2的累积方差贡献率为99.8%，远远大于85%，说明此次所选定测定的风味成分的贡献极大，基本可以代表样品的的整理信息；DI值代表区分度，DI值越大，表示区分效果越好，此次分析DI值为94.6%，远远大于85%，区分度极高，说明电子鼻能很好地应用于这6个橄榄油油样品的区分。

图4 不同品牌橄榄油间化合物含量比较分析图Fig.4 Comparative analysis of volatile compound content in six kinds of olive oil

图5 6种橄榄油气味特征主成分分析(PCA)图Fig.4 Principal component analysis of odor characteristic in six kinds of olive oil

结合图4、图5可以看出，对橄榄油风味贡献最大的醛类及醇类的含量在欧萨、爱琴尼雅及希波克中较为接近，与图5中3种样品相似度更高相符合，同时因为在酮类、酸类和芳香类中希波克的含量都明显高于其他几种油样，所以希波克单独处于第四象限内。由图4可知，贝蒂斯各类香气物质含量与其他几种油样相比普遍较低，所以与其他油样也有较大的区分度，由图5可得贝蒂斯独自处于第一象限。品利和欧丽薇兰由于各种类型香气物质含量居中，与其他几种样品也都具有一定的相似度，所以在图5中也处于几类样品之间。综上所述，SPME-GC-O-MS与电子鼻所测结果基本相符。

3 结论

采用SPME-GC-O-MS分离鉴定了来自西班牙、意大利和希腊的6种特级初榨橄榄油的挥发性香气成分。在6个不同品牌的特级初榨橄榄油中共鉴定出了65种风味化合物，其中可嗅闻到的有21种，主要是小分子醛和醇，还有一些相应的酮、酸、酯及帖烯类也有发挥作用。特级初榨橄榄油中特征香气成分有反-2-己烯醛、己醛、反-2-壬烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮和顺-3-己烯-1-醇等，由定量结果可得各香气物质含量的差异导致不同品牌橄榄油风味的差异。感官评价表明果香、青草味、油脂味和甜味为橄榄油的主要风味，与SPME-GC-O-MS检测所得结果基本吻合。电子鼻结合PCA分析检测中通过对其累计方差贡献率及区分度的计算分析得出电子鼻能很好的应用于这6种橄榄油的区分鉴定，结合SPME-GC-O-MS所得各类香气化合物含量与电子鼻相似度对比分析可得二者所测结果基本相符。综上所述，感官评价、气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O-MS)联用及电子鼻结合PCA分析可以较好的对特级初榨橄榄油中的挥发性香气成分进行比较研究。