酱油关键风味物质及其功能与发酵工艺研究进展

朱莉，许长华

(上海海洋大学 食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海)，上海，201306)

随着餐饮业的发展，酱油的人均消费量逐渐提升，高品质的酱油市场需求逐渐增大[1]，这就加快了酱油的升级速度，并加快了对酱油更进一步的科学研究速度。

酱油俗称豉油，主要由大豆、小麦、食盐经制曲、发酵等程序酿制而成。酱油的成分比较复杂，除食盐外，还有多种氨基酸、有机酸、糖类、香料及色素等成分[2]，不同的成分具有其独特的功能。

对酱油研究较为深入的国家是韩国、日本等亚洲发达国家[3]。同时，中国各大品牌的酱油研发人员也在不断改善和优化酱油风味，本文综述了酱油发酵工艺，并且对酱油关键风味物质研究进展以及酱油的功能进行了综述，以期为后期酱油的相关研究提供参考。

1 酱油发酵工艺

1.1 高盐稀态发酵

高盐稀态发酵指从日本引进的酿造工艺，具有水分含量多、盐分高、温度适中、发酵周期长等特点。现采用高盐稀态发酵工艺的企业有和田宽、石家庄珍极、绍兴至味、日本龟甲万等。高盐稀态发酵工艺的关键点在于发酵状态，即高盐度稀醪状态，高盐指盐水19～20 °P，盐度高于低盐固态发酵，稀醪指加入盐水的体积是原料体积的1.1～1.2倍，即酱醪较稀。高盐稀态发酵由于盐分含量高，即使发酵温度降低，多种耐盐微生物生存发酵也会产生较多的风味物质。此发酵工艺发酵周期长，通常180 d以上，有利于发酵更彻底，风味物质更丰富。同时高盐稀态发酵经常添加乳酸菌、耐盐酵母菌等能产生有机酸、醇、酯等改善酱油风味物质的菌株，这些菌株促成了高盐稀态发酵酱油300多种香气物质的生成[4]。高盐稀态发酵酱油方法又分为浸出法和压滤法，两法成熟酱醪提取酱油的方法不同，浸出法发酵容器型式不限，发酵池、发酵缸均可，但使用材质应能防止腐蚀；压滤法生产设备的投资很大，且发酵期长(一般 5～6 个月)，所以目前采用这种技术发酵的企业不多[5-6]。

1.2 低盐固态发酵

低盐固态发酵是我国20世纪70年代普遍推行的一种工艺，国内很多企业一直延用至今。此工艺通常以脱脂大豆及麸皮为原料，经蒸煮、冷却，米曲霉制曲后与盐水混合成固态酱醅，42 ℃保温发酵。该工艺是在无盐发酵基础上改进而成，由于其拌曲盐水浓度在12 °P左右，较低，故称为低盐。而其加水量与原料比例为 1∶1，为固态酱醅，发酵温度在42 ℃以上，故称为低盐固态发酵。因为发酵盐分低、水量少，反应物浓度变大，菌种繁殖代谢加快，发酵速度快，故成熟期缩短[7]。

低盐固态发酵由于工艺简单，相比于高盐稀态发酵工艺其原料成本较低，需要的投资少，所以20世纪70年代后在全国很快推广开来。但该工艺又存在产品口味单一、色泽暗淡、焦煳味重等缺陷，目前已经开发了一些其他改进工艺来降低发酵温度，延长发酵周期，最普遍的是淋浇发酵工艺。

1.3 淋浇发酵

目前，很多酱油发酵工厂还采用酱缸发酵，但是酱缸中的温度、氧浓度、酸碱度都不能很好的控制。于是南方就产生了一种普遍流行的大罐淋浇工艺，即在发酵前期或后期进行淋浇，这样不仅能够对温度进行调节，还能够使微生物得到氧气，并且后期出油时，直接从淋浇的设备中抽出酱油即可，并且还可以避免压榨设备对酱油发酵的影响。目前很多以低盐固态工艺发酵生产酱油的企业在发酵初期就开始进行淋浇，即不降低温度也不改变盐度、pH、糖度等进行发酵，这种工艺对酱醅里的成分、温度的均匀度都有好处，之后淋油也会畅通，且淋浇出来的酱油色泽光亮，没有焦煳味，相比低盐固态发酵酱油其风味可以大大改善[8-10]。

但是淋浇发酵工艺较易染菌，需要较高标准的卫生环境，同时要有实时控制好发酵温度、pH、糖度等参数的设备。

1.4 传统发酵

传统酱缸发酵也被称为纯天然发酵，主要原料是小麦、黄豆、黑豆或脱脂大豆，也有原料全部为面粉的传统发酵，比如甜油[11]。发酵方式有液态和固态两种。液态发酵需加入2倍多的盐水，酱油以稀醪状呈现，而固态发酵即只加入比原料多1倍的盐水，以半固态状呈现[12]，大缸露天发酵具有一般传统发酵的共同特征。发酵过程中，晴天将酱缸盖打开，日晒夜露，一般一个夏季的时间让其充分发酵，秋季末榨出油。传统酱缸发酵在晒酱时的温度很高，酵母等其他低温生长菌株难以生长，但其他菌种特别是耐高温菌种的生长繁殖加快，这些菌种的代谢会产生大量的香味物质，这些香味物质往往促成了传统发酵酱油独特且不可替代的风味[13]。

表1 比较了不同发酵工艺的特点，可以发现不同酱油发酵工艺有自己的优势和不足，不同企业根据其不同需求选择相应工艺。

表1 酱油工艺对比表Table 1 The correlation table of soy sauce process

2 酱油中关键风味物质研究进展

近些年来，酱油作为一种有着悠久历史的调味品，其独特的风味也是科学家们研究的重点。CHOI[16]等人基于42个大麦麸皮酿造的酱汁样品，通过多元回归分析(NfRA)法研究了酱油的气相色谱(GC)图谱与酱油感官分析中各香气成分排列顺序之间的关系，发现9，12-十八烷酸甲酯的含量最高，其次是2-呋喃甲醇和2-呋喃甲醛。YOSHIKAWA[17]等认为2-苯基乙醇(2-PE)和4-羟基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃酮(HEMF)和酱油发酵中产生4-乙基愈创木酚(4-EG)是酱油中的特征性风味化合物。ZHENG[18]等人比较了不同发酵过程(低温固态发酵(LSSF)，高盐稀释态发酵(HSDF)和高盐恒温发酵(HSCT))培养的中国酱油中的挥发性香气化合物，发现LSSF醪液中挥发性香气化合物总浓度是最高的，LSSF醪液中还存在高含量的2，3-丁二醇和2，6-二甲基吡嗪；但亚油酸乙酯和油酸乙酯主要在HSCT醪液中，LSSF醪液中很少。LEE，SM[19]等人通过溶剂萃取和固相微萃取的分析方法，分别分离了发酵酱油和酸水解酱油中的挥发性化合物，总结发现发酵酱油的主要气味活性化合物是乙酸，糠醇，2-甲氧基苯酚，苯乙醇，苯甲酸，丁酸，2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)呋喃酮和2-2-甲基丁醛，而酸水解酱油的主要气味活性化合物是乙酸，2-甲氧基苯酚，甲酸，苯甲酸，2，5-二甲基吡嗪，2，6-二甲基吡嗪，丁酸，2，6-二甲氧基苯酚，3-羟基-2-甲基-4H-吡喃-4 - 酮，2-乙酰基-5-甲基呋喃，2，5-二甲基-3-乙基吡嗪和2-甲基丁醛。SONG[20]等人通过GC-MS分析了酱油发酵过程中62种挥发性化合物的变化，发酵初期，醇、酮和吡嗪是主要的风味贡献者，而随着发酵的进行，酸与醛的丰度逐渐增加。KANEKO[21]等人通过芳香提取物稀释分析技术(AEDA)，以日本酱油的香味浓缩物为研究对象，研究结果揭示了日本酱油中40种关键芳香化合物，其中包括7种新鉴定的化合物，其中，5(或2)-乙基-4-羟基-2(或5 -甲基-3(2H)-呋喃酮和3-羟基-4，5-二甲基-2 - 呋喃酮对酱油香气贡献度最高，(FD)因子为2048，3-(甲硫基)丙醛；4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-羟基-2，5-二甲基-3(2H) - 呋喃酮贡献度次之。KURODA[22]等人通过HPLC-MS和串联质谱(LC / MS / MS)等方法，以6种商业品牌的深色酱油，2种品牌的浅色酱油和一种品牌的白色酱油为研究对象，研究了各酱油γ-Glu-Val-Gly的含量，结果表明所有研究的大豆酱中都存在γ-Glu-Val-Gly，且质量浓度范围为0.15～0.61 mg/dL。

不同原料以及不同发酵工艺所生产出来的酱油，其风味物质的种类和数量不尽相同，并且采用不同的提取方法和分析仪器分析风味物质时，最终鉴定出的风味物质数量和种类也有较大差别，但无论在何种工艺发酵的酱油中，也无论采用何种分析方法，对酱油风味起着关键作用且贡献较大的特征性香气成分却大致相同，如4-乙基愈创木酚、4-羟基-2(或5)-乙基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)等[23]。

3 酱油的功能特性

3.1 杀菌作用与多种营养物质

实验发现p3羟基苯甲酸在酱油中有杀死病原菌的作用[12]。目前能解释酱油杀菌机理的相关报道表明：NaCl、酒精、防腐剂的存在有助于杀菌，特定的温度、pH值加强了杀菌的作用。对食物中易引起食物中毒的微生物有一定的杀菌效果。除此之外，酱油可能还存在其他具有抗菌作用的成分，有待进一步鉴定[24]。酱油不仅仅含有丰富的蛋白质，多种人体所必须的氨基酸，糖分和VB12、VB1、VB2、VE，锌、钙、铁、锰等微量元素也可以在酱油中找到[25]。

3.2 抗氧化作用

WANG[26]等发现，酱油中甲氨基酚、类黑精素等在体外抗氧化活性很高；KATAOKA等[35]实验表明，HEMF, HDMF和HMF，Leu-Leu-Pro-His-His多肽对酱油抗氧化活性具有一定贡献。酱油发酵中的美拉德反应是一类很重要的反应，而美拉德反应经常产生类黑精等一系列含N、S的棕褐色挥发性杂环化合物，这些物质的等电点一般在 pH 2～3范围内，呈青色荧光，是酸性的高分子。这些挥发性杂环化合物的游离基比较稳定，不易被水解酶水解且不易自己降解，所以这种物质能稳定存在并能消除活性氧，提高过氧化物酶、过氧化氢酶等活性。这就是酱油具有一定的抗诱变、抗氧化和消除活性氧等功能的机理[27]，这些物质的抗氧化的功效有的甚至比VC和VE高十几倍[24]。

3.3 抗癌作用

早在1991年，BENJAMIN等在酱油抗癌性动物实验中，就已经发现酱油中的呋喃酮类，包括HEMF[(4-羟基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃酮] 、(HMF)4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮和(HDMF) 4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等，都能降低人多形核白细胞中的H2O2浓度，特别是HEMF[(4-羟基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃酮]，HEMF已经多次被证实为一种重要的，且具有较强的抗癌作用的风味物质，其抗氧化性强于VC，也有抑制肿瘤的效果[12, 24]。此外，酱油中有检测到异黄酮类物质，比如黄豆苷和大豆苷，此类异黄酮苷类物质抗氧化活性也很高，并且在临床中发现能预防前列腺癌、乳癌等疾病[28-29]，美国癌症治疗中心已经把诸如此类的异黄酮作为治疗乳腺癌疾病的药物[30]。

3.4 促进胃液分泌

KOJIMA等[32-33]将25 mL日式酱油加入300 mL热水中，制成酱油稀释液，让15个人服用，他们的胃液分泌量平均为46.8 mL，对照组将25 mL咖啡因(常用于诱导胃液分泌)加入300 mL热水，制成咖啡因稀释液，让15个人服用，他们的胃液分泌量平均为44.0 mL。因此酱油稀释液诱导产生的胃液比咖啡因稀释液还多。此项研究证明了酱油中可能存在某些特殊的生物活性物质,能起到促进胃液分泌的作用[31]。

3.5 其他功能

SASAKI等[38]发现,HEMF, HDMF和HMF除了具有抗癌和抗肿瘤作用外，还具有一定的反癣作用。TSUCHIYA通过高效液相色谱分析酱油，发现酱油中含有能抗血小板产生的功能物质。表2将酱油的各种功能总结，显示出酱油还有抗过敏，治疗贫血等作用。

4 展望与总结

综上所述，酱油工艺的发展速度逐渐加快，工艺种类也越来越多，但具体哪种发酵方式最受欢迎，风味最好，还受多方面因素影响。研究酱油关键风味物质的科学家虽然已经通过多种方法检测出了多种风味物质成分，但每种成分的具体作用，以及它们之间的相互作用的相关报道太少，其机理有待进一步探索，并且根据各企业酱油的关键风味物质及其相互作用，开发或改善其发酵工艺是一件非常有意义的研究工作。

表2 酱油功能研究总结表Table 2 The conclusive table of the function of soy sauce

注：ABTS，2，2′-氮杂双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)； DPPH，1,1-二苯基-2-苦基肼； HDMF，4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮； HEMF，4-羟基-2(或5)- 乙基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮； HMF，4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮

酱油的众多功能中抗氧化作用和抗癌作用是比较显著的，值得注意的是HEMF, HDMF和HMF不仅仅在风味上有很大的贡献，功能上还具备抗氧化作用和抗癌作用，然而其作用机制还有待研究。