采用特制化学处理剂降解发酵药渣中残留四环素的研究

卜春苗，陈卫民

（1.宁夏大学化学化工学院，宁夏银川 750021；2.宁夏大学环境工程学院，宁夏银川 750021）

宁夏地区由于气候条件，粮食资源，能源资源非常适合发酵工业的发展。然而排放的大量废水和废渣也带来了环境的严重污染和资源的浪费。如何使这些废弃物得到无害化处理与有效的循环利用，是亟待解决的重要问题。但从目前对药渣的无害化处理与资源利用状况看，却存在着严重的污染和利用不合理，大部分为禽畜所利用和肥田，少量废弃直接排入下水，既造成资源的浪费，又污染环境，同时对食品的安全产生巨大的威胁。由此可见，发酵药渣的无害化处理与资源利用已迫在眉睫。

四环素（tetracycline，TC）发酵药渣是以淀粉、葡萄糖、蛋白胨为主要原料作培养基发酵提取药物后的副产品，粗蛋白含量在48%以上，是非常有价值的动物蛋白饲料待开发的原料[1]。但是，原渣中含有微量的四环素，直接作为蛋白饲料原料利用，会造成动物产品中含有抗生素药残，存在食品安全隐患，必须降解处理后才可以利用。

目前，国内外对于环境水样中残留抗生素降解的研究报道较多，常采用的方法有光降解[2]、水解[4]、氧化降解[5]、生物降解[6]、吸附法[7]等。但是，对于抗生素药渣治理与资源化方面的研究报道较少。

宁夏大学环境工程学院陈卫民课题组，经过多年的努力，研制出一种特殊的化学处理剂：经过脱脂、脱胶、脱腊、脱酸处理的大豆油脂（已获授权发明专利，专利号：200610137031.7），提出采用理化复合技术，在确保药渣固有的营养价值的基础上实现降解药渣中残留四环素。本文重点考察所研制化学处理剂对四环素的降解性能，以四环素生产药渣为研究对象，验证对残留四环素的降解效果，皆为四环素废弃药渣环保处理及资源化利用提供新的解决办法。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

LC-20AD液相色谱仪（Shimadzu）；Xevo TQ-S三重四级杆质谱系统；Oasis MCX多功能净化柱（Waters）；B-400 均质仪（Buchi）；平行样品浓缩仪（Buchi）；台式冷冻离心机；超纯水仪；漩涡混合器。四环素标准品（纯度≥99%，Sigma）；甲醇、乙腈（色谱纯，TEDLA）；乙酸铵（分析纯，科密欧有限公司）。

1.2 四环素测定

1.2.1 配制标准储备液 称取25.00 mg四环素标准物质于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释即得250.00 mg/L，避光保存。

1.2.2 测定条件 色谱柱InertSustain HC-C18（4.6×150 mm，5 μm），检测波长 355 nm；柱温 35 ℃；进样量20 μL；流动相为有机相（乙腈：甲醇=2：1）-水相（0.01 mol/L草酸）=35：65（V/V）；流速：1.0 mL/min。

1.2.3 标准曲线 分别移取250.00 mg/L TC溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 于 50 mL 容量瓶中，甲醇定容得到 10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L 和 50 mg/L 标准溶液，采用HPLC测定标液峰面积，绘制标准曲线，线性方程：y=35 474.26X+70 364.8，R2=0.990 59。

1.3 降解实验

以25 mg/mL四环素标准溶液为样品，分别加入不同剂量的处理剂，在200 r/min搅拌下，不同时间内取样静止沉降30 min，于液面下1 cm处取上清液并测定其四环素含量。四环素含量采用高效液相色谱法测定，根据标曲计算残留四环素含量，计算去除率。四环素去除率的计算公示如下

式中：C0－四环素药渣中初始浓度；Ct－处理后残留四环素浓度。

1.4 药渣降解实验测定

1.4.1 药渣样品降解 药渣降解实验在特制的反应容器中进行，在一定量药渣样品中加入不同用量的化学处理剂，收集药渣样品。

1.4.2 药渣样品测定 分别对原渣、降解药渣样品经过提取、净化处理后，后用液相色谱-串联质谱（LCMS/MS）分析。提取：称取1.0 g原渣、降解药渣样品于50 mL离心管中，分别加入100 μL不同浓度四环素标准溶液（0.1 mg/mL，0.2mg/mL，0.3 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL）和5 mL 4%氯化钠溶液，充分匀浆后加入5 mL乙腈，涡旋混匀，超声提取10 min。再加入10 mL乙酸乙酯，振荡提取5 min，-4℃，12 000 r/min离心5 min，取上层有机相待净化。净化：Oasis MCX小柱，依次用3 mL甲醇和3 mL乙酸乙酯活化后，取5.0 mL上层有机相重力过柱，收集溶液。待过柱完成后，用2 mL乙酸乙酯淋洗，再用2 mL甲醇淋洗小柱，后用3 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液。将洗脱液置于氮吹仪上吹干，再用10%甲醇-水溶液定容至1 mL，涡旋30 s，采用0.2 μm GD/Nylon多层针头式滤器过滤，后采用LC-MS/MS，测定处理药渣中四环素残留量。测试条件：ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温40℃，样品室温度20℃，流速0.3 mL/min，进样体积5.0 μL，流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，每个实验平行3次，根据测定样品中四环素残留量，计算去除效率（见表1）。

表1 以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相梯度洗脱程序

2 实验结果与讨论

2.1 不同处理剂用量对TC降解的影响

实验采用不同处理剂用量对250 mg/L TC溶液降解2 h，处理剂用量相对于TC的质量分数为：2%，4%，6%，8%和10%，处理剂用量对四环素的去除效果（见图 1）。

图1 处理剂用量对四环素降解率的影响

由图1可知，当体系中TC浓度为56 μm，降解时间为2 h时，加入2%处理剂的量，TC降解率为44.86%，随着处理剂用量的增加，TC去除率呈现上升趋势，当处理剂增加至8%时，TC去除率为74.8%，但随着处理剂用量的继续增加，TC的去除率基本保持不变。

2.2 时间对TC降解的影响

继续探讨降解时间对TC去除率的影响，分别对56 μm的TC溶液加入不同处理剂用量，考察在降解时间为：0.5 h，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，7 h，8 h，9 h，10 h，11 h，12 h下处理剂对TC的去除效果，结果（见图2），结果显示，在不同处理剂用量下，随着降解时间的延长，TC的去除率逐渐上升，当降解时间为10 h时，在不同处理剂用量下，TC的去除率都达到最大值，而随着时间的继续增长，TC去除率基本保持不变。在2%，4%，6%，8%和10%处理剂用量下，TC的去除率最大分别能达到：52.64%、65.4%、77.03%、97.00%、95.98%，结果证明，10 h的降解时间，8%的处理剂用量，TC的去除效果最优。

3 用于药渣实际样品中四环素的去除

3.1 药渣样品中残留四环素的检测

进一步验证处理剂对实际药渣样品的处理能力。在1.0 g药渣样品中加入20%、25%和30%（W/W）的特制处理剂，降解时间10 h，将降解药渣样品经提取、净化处理后，提取液通过LC-MS/MS检测，采用空白基质加标定量方法，对降解药渣中四环素含量进行测定。四环素标液，原药渣和药渣降解后阳性样品的对照谱图（见图3），可以看出，与原药渣样品谱图进行对比，降解药渣中四环素的峰明显降低，证明处理剂具有去除药渣中四环素的能力。

图2 处理时间对四环素降解率的影响

3.2 药渣样品中四环素的去除

药渣本身四环素的含量较高（225 μm～338 μm），根据2.1中考察处理剂用量与四环素去除率间的关系，在药渣样品中分别加入相对于药渣样品：20%、25%和30%（W/W）的处理剂量，测定药渣中四环素的去除率，结果（见表2），加入20%、25%和 30%（W/W）的化学处理剂，降解10 h后，25%和30%的降解率为81.8%和82%，结果证明采用25%的化学处理试剂，能最大去除药渣中四环素的残留量。也表明，当处理剂应用于实际样品药渣中，由于体系的复杂性，与单一的四环素溶液相比，四环素的去除量稍有降低。

表2 化学处理试剂用量对药渣中四环素的去除

图3 标准四环素溶液、原渣和降解药渣中阳性样品的LC-MS/MS谱图

3.3 化学处理-紫外光协助降解药渣样品中的四环素

图4 紫外照射时间对四环素降解的影响

光降解是降解四环素的一种重要途径。为了进一步提高药渣中四环素的降解效果，拟采用光降解和化学处理剂相结合的方法，验证对四环素的降解性能。研究已经证实254 nm紫外光照射对四环素具有较强的光解作用[5]，本文在加入25%的特制化学处理剂条件下，采用254 nm紫外光照射，分别测定0 h，5 h，10 h，15 h光照时间下药渣中四环素的残留量，计算去除率。结果（见图4），随着光照射时间的延长，四环素的降解率由81.8%提高到91%，实现了进一步提高四环素降解效果的目的，表明本文采用的化学处理-紫外光降解的方式在去除药渣中残留四环素方面具有潜在的应用价值。

4 结论

本文以降解药渣中残留四环素为目标，采用特制化学处理剂：大豆卵油脂，并结合254 nm紫外光照射相结合的方式，探讨对四环素的降解性能，结果表明：

（1）采用特制化学处理剂（自制大豆卵油脂），8%的处理剂用量（W/W，相对于四环素），10 h下，可降解53 μm的四环素。

（2）将其用于四环素药渣原样中四环素的去除，加入25%的化学处理剂（W/W，相对于药渣样品），降解10 h，四环素的去除率最大能达到81.8%。

（3）为了进一步提高四环素的降解率，采用化学处理和紫外光降解相结合的方式。结果显示，在20%的化学处理剂用量下，254 nm下采用紫外光照射，药渣中四环素的降解率高达91%，高于目前文献报道值，证明本文方法在降解四环素残留中具有潜力。